Способ получения гриппозного антигенного нейраминидазного эритроцитарного диагностикума Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 A61K39/12 

I

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для приготовления гриппозного диагности- кума.

Целью изобретения является повышение специфичности, чувствительности и стабильности диагностикума за счет повторного использования нейра- минидазного антигена и смеси трех порций сенсибилизированных им эритроцитов .

Способ осуществляют следующим образом.

50%-ную взвесь эритроцитов барана, формалинизированных по CsizrcazL1960, отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин 30-кратным объемом физиологического раствора рН Т,2-1,25 (раствор № 1) и доводят до 2,5%-ной концентрации раствором I 2 (1/15 М фосфатный буфер рН 7,2-7,25, содержащий 0,85% HaCl). Отмытую 2,5%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000, приготовленного на растворе № 2. Смесь вьщерживают 10 мин при комнатной температуре (20 С), дважды отмьгеают 10-кратным объемом раствора К 1 , ресуспендируют до 2,5%-ной концентрации в 1/15 М фосфатном буфере рН 6,4-6,5, содержащем 0,85% NaCl (раствор № 3) и сенсибилизируют оптимальной дозой ней- раминидазного антигена вируса гриппа.

Для выбора оптимальной сенсибилизирующей дозы нейраминидазного антигена в ряд пробирок с 5 мл 2,5%-ной взвеси формалинизированных танизиро ванных эритроцитов добавляют антиген в количестве 0,25-1,2 мл. После 20 ч контакта при 37 С к эритроцитам добавляют по 0,05 мл нейтрального формалина и через час контакта при тех же условиях сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают 40-кратиым объемом раствора № 4 (за буференный 0,85%-ный раствор NaCl, рН 7,2-7,25 с нейтральным формалином в конечной концентрации 1%). К осадку эритроцитов в каждую пробирку добавляют по 5 мл раствора N 2 и по 0,05 мл нейтрального формалина выдерживают 12 ч в термостате при и с полученными диагностикума- ми ставят реакцию.

567482

Рабочей дозой ;нейраминидазногр. антигена считают то его количество, при котором полученный диагностикум агглютинирует гомологичную сыворот- 5 ку до наибольшего разведения при отсутствии реакции в контроле.

Выбранную дозу нейраминидазного антигена вируса гриппа в перерасчете на соответствующий объем добавля- 10 ют к 2,5%-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов, перемешивают в стеклянной емкости- с резиновой пробкой и помещают в термостат при на 20 ч. Перемещиts вание производят каждые 2 ч.

После этого взвесь эритроцитов центрифугируют при 2500 об/мин без добавления формалина. К полученной надосадочной жидкости добавляют 10%

20 первоначального объема нейраминидазного антигена и при тех же условиях сенсибилизируют новую партию эритроцитов. Таким же образом надосадок использ тот в третий раз, добавляя

25 к нему 20% п ервоначального объема нейраминидазного антигена.

Осадки сенсибилизированных эритроцитов трижды отмывают 40-кратным объемом раствора № 4, доводят до

30 2,5%-ной концентрации раствором №2, добавляют нейтральный формалин до 1%-ной концентрации и объединяют. Готовые диагностикумы выдерживают в термостате при в течение 12ч.

35 Пример.5 мл 50%-ной взвеси эритроцитов барана, формалинизированных по Csizmas , трехкратно отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин 150 мл раствора №1.

40 Для приготовления 2,5%-ной взвеси к 5 мл 50%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов до 100 мл раствора № 2. Полученную взвесь зрит троцитов смешивают с равным объемом

45 раствора танина 1:20000. Танизация i длитср 1 О мин при комнатной температуре (20°С). Осаждение эритроцитов производят при том же режиме центрифугирования, после чего их трижды

50 отмывают 300 мл раствора № 1.

(К осадку отмытых формалинизирован- ных танизированных эритроцитов добавляют 100 мл раствора № 3 для получения 2,5%-ной взвеси, после чего

55 производят сенсибилизацию эритроцитов нейраминидаэным антигеном вируса гриппа, приготовленным твин-эфир- ным способом (разрушение вируса грип3

па твином-80 в конечной концентрации 0,2% и .половинным объемом- эфира без подщелачивания и использование для осветления препарата обработки фреоном- 113).

Рабочая доза нейраминидазного антигена штамма вируса гриппа А/Техас 1/77 (активность в единицах экстинции Ер 0,700/0,1 мл) составила 0,5 мл антигена на 5 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов или 10 мл антигена на 100 мл 2,5%-ной взвеси формалинизированный тализиро- Ъ аннЪк эритроцитов. Смесь антигена и 2,5%-ной взвеси эритроцитов помещают в термостат при 37°С на 20 ч, перемешивают каждые 2 ч. Через 20 ч контакта без добавления формалина взвесь эритроцитов центрифугируют.

Осадок сенсибилизированных эритроцитов трижды отмывают 400 мл раствора № 4, ресуспендируют в 100 мл раствора № 2 и добавляют I мл нейтрального формалина.

ор М. Циткина 4854/3

Составитель М. Васильев Техред И.Верес

Кор Под

Тираж 660 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

484

Отделенным надосадком (100 мл), к которому добавляют 1 мл нейраминидазного антигена, ресуспендируют до 2,5%-ной концентрации осадок све- жей порции отмытых формалинизирован- ных танизированных эритроцитов, помещают в термостат при на 20 ч при постоянном помешивании, после чего осадок эритроцитов обрабатьшаю

как и в первом случае, а полученным надосадком (100 мл)после добавления 2 мл нейраминидазного антигена суспендируют до 2,5%-ной взвеси осадок третьей порции формалинизированных

танизированных эритроцитов и обрабатывают аналогичным способом.

Объединяют осадки и полученный таким образом диагностикум вьщержи- вают 12 ч при .

Полученньш диагностикум может использоваться в РИГА для диагностики гриппа и определения популяционного антинейраминидазного иммунитета.

Корректор О. Луговая Подписное