Способ выделения фосфолипазы А2 из яда кобры Советский патент 1990 года по МПК A61K38/46 

Изобретение относится к ферментной промь1шленности, в частности к получению чистой фосфолипазы А из яда кобры.

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение степени очистки целевого продукта.

Пример 1. К 1,0г яда кобры добавляют 8,0 мл раствора 0,045 М уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью 4, S см, рН 7,4, смесь медленно перемешивают 4 ч при 4°С. Растворенный яд цед1Трифугируют при 5000 об/мин при в течение 30 мин. Осадок выбрасывают., насадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную с 0,045 М раствором уксусно-кислого

аммония (удельная электропроводность 4,4-10 S , рН 7,4) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки

00 00 2,1 f-i6 см) наносят раствор яда. Ког- лонку злюируют с 0,045 М раствором

со уксусно-кислого аммония с удельной

4 электропроводностью 4,4 S ,

00 рН 7,4 со скоростью 30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата. регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-11. Остальные компоненты яда кобры кроме фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаза А, имеющая оптиму 4 гидрофобности и активно : сти при рЦ.7,5, связывается на пентил-агарозе и ее элюируют градиентом ионной силь концентрацией уксуснокислого аммония 0,45 М с удельной электропроводнйстыо 32-10 S см , рН 7,4. Фракции, имеющие фосфолипазную активность, объединяют (выход 92 мл) и лиофилизируют дважды.

Характеристика препарата: выход 65,1%. Степень очистки 25 раз.

..П ример2. К 1,0г яда кобры добавляют 8,0 мл раствора 0,050 М уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью 4,510 S см рН 7,5, смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при . Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при в течение 30 мин. Осадок выбрасьшают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную с 0,050 М раствором уксусно-кислого аммония (удельная электропроводность 4, S см рН 7;5) колонку с пентш1 агарозой (размеры колонки 2,1 К 16 см) наносят раствор яда.

Колонку промывают с 0,050 М раствором уксусно-киелого аммония с ;-удельной электропроводностью 4,5)С к 10 S , рН 7,5 со скоростью 30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда11, Остальные компоненты яда кобры кроме фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаза А-, имеющая оптимум гидрофобности и активности при рН 7,5, связывается на пентил-агарозе и ее элюируют 0,50 М раствором уксусно-кислого ам;Мония с удельной электропроводно-,стью 34-10 S cM SpH 7,5. Фракции имеющие фосфолипазную активность, объединяют (объем 90 мл) и лиофилизируют дважды.

Выход препарата 65,3% и степень очистки 25,2 раз.

Примерз. К 1,0г яда добавляют 8,0 мл раствора 0,055 М уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 4,6,-10 S см , рН 7,6 смесь медленно перемешивают 4 ч при . Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На ура вновешенную с 0,055 раствором уксусно-кислого аммония (удельная электропроводность 4,6)С iflO S , рН 7,6) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки 2,1 х16) наносят раствор яда.

Колрн1су промь1вают с 0,055 Д раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью 4,6 0 S см , рН 7,6 со скоростью 30 мл/ч, собирают фракции по 15 мп. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда-11. Остальные компоненты яда кроме фосфолипазы Ag в данных условиях проходят колонку, афосфолипаза А„, имеющая оптимум гидрофобности и активности при рН 7,5 связывается на пентил-агарозу и ее элюируют 0,55 М раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью 36.10 S см , рН 7,6. Фракции, содержащие фосфолипазную активность, объединяют (объем 92 мл) и лиофилизирзпот дважды.

Выход препарата 65,0% и степень очистки25 раз.

Технико-экономическая эффектна-. ность использования предлагаемого способа выражается в возможности количественного вьщеления фосфолипазы А из яда кобры простым и дешевым способом, а остальной яд без фосфс- .липазы А можно использовать для получения других биоактивных белков или после высушивания сохранить.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ AJ, ИЗ ЯДА КОБРЫ, вк.гаочаюш;нй растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, выделе- / нием целевого продукта путем аффинной хроматографии, элюции и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьшения степени очистки целевого продукта, растворение проводят в 0,045-0,055 М буферном растворе уксуско-кислого аммония при рй 7,4-7,6, хроматограф1го осуществляют на пенткл-агарозе Б -r.oj же бу зерном растворе, а злюцию в 0,45-0,55 М растворе уксусно-кислого амьюния и лиофилизируют полученньм раствор двгкды. $