Способ получения фосфодиэстеразы Советский патент 1982 года по МПК A61K35/58 

(5|) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ

1

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности.

Известен способ получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделения с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования СП.

Однако этот способ не обеспечивает высокой активности и степени чистоты препарата (степень очистки 2-3 раза, содержащие эндонуклеазы 5 ЕА/мг).

Цель изобретения - повышение активности и степени чистоты.

Цель достигается тем, что согласно способу получения фосфодиэстеразы путем растворения яда гюрзы, центрифугирования, хроматографического разделемия с последующим выделением целевого продукта в процессе элюирования, растворение яда проводят в растворе уксуснокислого аммония, после центрифугирования надосадочную жидкость подвергают гельфильтрации на сефадексе Г-100, полученный раствор концентрируют ультрафильтрацией, ультрафильтрированный раствор хрома- тографируют на колонке с карбоксиметилцеллюлозой и элюируют раствором уксуснокислого аммония, причем удельную электропроводность элюэнта берут

S см

в градиенте от (1.7-1,9)

10 до (63-65) - 10 ScM-1

10

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония, центрифугируют, осадок выбрасывают, надосадоч 5ную жидкость используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят с раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью (15 16) 10 S CMt полученные фракции

20 экзонуклеаз с приблизительно одинаковым молекулярным весом обессоливают до удельной электропроводности раствора (1,7-1,9) кон39центрируют с помощью ультрафильтрации. Полученную смесь наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой при линейном градиенте элюирования от удельной электропроводности раствора уксуснокислого аммония (1,7-1,9) х X см- до (бЗ-б5)-10 S см-при постоянной рН среды, получают три белковых пика. Фракции, содержащие фосфодиэстеразу объединяют (II пик) и высушивают лиофильно. Степень очистки раз; активность фосфодиэстеразы 0,32-0,4-ед/мг; примесь эндонуклеазы (рибонуклеазы) отсутствует-, примесь 5-нуклеотидазы менее 2,8ч О ед/мг; примесь неспецифической фосфомоноэстеразы менее t,5-10- ед/мг. Пример1.К4,8г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,3-10 S см смесь медленно перемешивают в течение 30 мин при С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 1 5-3-10 ) ко лонку с сефадексом Г-100 сверхтонким (размеры колонки 4,2 х 140 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электро проводностью 15,3-10 S со ско ростью 13 мл/ч и собирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда-11. Получают 9 белковых пиков. В I и II пике фракции, которы имеют фосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 200 мл) и ультрафильтрируют до выхода 20 мл нуклеазногс раствора с удельной электропроводностью 1,7-1 доводят рН 10%-ной уксусной кислотой до рН 5,5. Ультрафильтрированный раствор наносят на уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность раствора 1,7 х X ) колонку карбоксиметилцеллюлозы КМ-52. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония рН 5,5 (удельная электропроводность раствора 1, ) и начинают градиентное элюирование при постоянном рН 5,5, линейно увеличивая удельную электропроводность от 1, (количество раствора 1 л) до 63-10 3S см (количество раствора 1 л). Скорость элюации 45 мл/ч, собирают ся фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Во фракциях определяют фосфодиэстеразную активность (субстрат Са соль-бис-пара-нитрофенилфосфата). При ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе получают три белковых пика (П пик содержит фосфодиэстеразу). Фракции, содержащие фосфодиэстеразу, объединяют (П пик выход 170 мл) и высушивают лиофильно. Выход лиофилизированного препарата 31 мг; степень очистки 30 раз; примесь эндонуклеазы отсутствует; активность фосфодиэстеразы 0,39 ед/мг препарата; примеси 5 нуклеотмдазы 2,6-10 ед/мг примеси неспецифической фосфомоноэстеразы 2,9-10.ед/мг препарата; содержание белка 79. Пример 2. К5,0г яда гюрзы добавляют 50 мл раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16,0 10 S , смесь медленно перемешивают в течение 4 ч. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации.. На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15, см1) колонку с сефадексом Г-100 сверхтонким с размером колонки 4,2 X l40 см наносят раствор яда. Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 16-10 S см со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 15 мл. Содержание белка во фракциях gnpeдепяют по экстинкции раствора при 280 нм на спектрофотометре СФ-4 в прямоугольных кюветах толщиной 1 см. По содержанию белка во фракциях рисуют хроматограмму, получают 9 белковых пиков. В I и II пике фракции, имеющие фосфодиэстеразную активность, объединяют (объем 210 мл) и ультрафильтруют до концентрации 20 мл и удельной электропроводности раствора 1,89 х X см-. Доводят рН уксусной кислоты до 5,5Ультрафильтрированный раствор наносят на уравновешенную раствором