Способ лиофильного высушивания оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы Советский патент 1990 года по МПК C12N9/02 

fO

f3

1130784

Изобретение относится к ферментой промышленности и представляет собой способ лиофильного высушивания ксидазы L-аминокислот из яда гюрзы з замороженного раствора, Получае- 5 ый продукт может быть использован л в научно-исследовательских целях ля изучения процессов транспорта аминокислот в процессе синтеза белка, а также для препаративного получения тироксина чистых В-изоме ров аминокис- от и об -кетокислот.

Целью изобретения является повьше- ие выхода по активности оксидазы -аминокислот.

Сущность изобретения заключается в том, что для лиофилизации используют раствор фермента с высокой концентрацией белка - 2-5 мг/мп. При Q иофилизации разбавленных растворов фермент инактивируется: на 50% при концентрации 1 мг/мл и 90% при 0,1 мг/мл. Для достижения высокого выхода по активности к буферному 25 раствору фермента дсгбавляют в качестве стабилизатора пептидную фракцию яда порзы с мол.м, 1000-1300 даль- тон, полученную с помощью гель-фильтрации. Весовое соотношение фермент - JQ стабилизатор должно составлять 17 : : 1 - 5:1..

П р и м е р А. 20 мл раствора оксндазы L-аминокислот (2,0 мг/мг) в 0,01 М буфере ацетата аммония, рН 5,5 дозируют по 0,5 мл, добавляют определенное количество стабилизатора, замораживают с помощью жидкого азота и высушивают лиофильно в лио- филизаторе ОЕ-950 (Венгрия) при Q температуре нагрева 20 С в течение 20 чt Для определения активности оксидазы L-аминокислот образцы растворяют в 0,02 И ацетатном буферном растворе (рН 5,5) и определяют мак- симальную скорость дезаминировалия L-лейцина по методике фирмы Wort- hington. Остато шую удельную активность оксидазы L-аминокислот сравнивают с исходной удельной активностью, jg

определенной после дозирования раст- вора. Полученные данные приведены в таблице.

П р и м е р Б. 25 мл раствора оксидазы L-аминокислот (5,0 мг/мп) в 0,03 М буфере ацетата аммония, рН 7,8, дозируют по 0,5 мл, добавля- - ют определенное количество стабилизатора, замораживают с помощью жидко35

O

3

84

5

Q 5 Q

Q jg

35

92

го азота, высучгнвают. лиофильно в лио- филизаторе ОЕ-950 (Венгрия) при иа1- реве 20 С в течение 20 ч и определят кгг удельную активность фермента. Результаты опытов приведены в таблице. Из таблицьт вытекает (1А и Б), что в отсутствии стабилизатора лиофиль- ное высушивание высокоочйщенной оксидазы L-аминокислот приводит к значительной потере активности фермента (А5-50%) и соответственно загрязнению препарата неактивным белком.

Из таблицы также видно, что добавление в раствор фермента глицина (как в прототипе) в некоторой мере увеличивает выход активности фермента (остаточная активность препарата увеличивается от 50 до 70%). При этом надо отметить, что добавление : глицина ограничивает использование оксидазы L-аминокислот, так как глицин является субстратом фермента,

В таблице приведены и результаты лиофильного высушивания оксидазы L-аминокислот яда гюрзы в присутствии ряда других ингредиентов: рибофлавина, кофермента ФАД, В-мальтозы, L-арабинозы, альбумина. Некоторые из них дали положительный результат при лиофилизации других ферментов. Из таблицы видно, что заметный стабилизирующий эффект достигается только в случае сахаров (до 80% остаточной активности),

Влияние добавки фракции яда гюрзы с мол.м. 1000-1300 является исключительной - уже при низком весовом соотношении 17:1. наблюдается практически 100%-ный выход целевого продукта при лиофилизации, а оптимальным является соотношение 10:1. При этом важно отметить, что введение в препарат оксидазы L-аминокислот небольшого количества инертного пептидного стабилизатора не мешает определению активности и использованню этого фермента. При соотношении 33:1 стабилизирующий э(1)фект уменьшается.

Из таблицы видно, что другие фр.ак- ции яда гюрзы, в частности фракции с.мол.м. 2000 и 5000, 1не имеют стабилизирующего эффекта. Модельный пептид с мол.м, 1060, брадикинин, также не имел стабклизирующего эффекта, сравнимого с влиянием фракции яда порзы с мол.м. от 1000 до 1300, Из этих данных следует, что стабилнзи- рующий эффект указанной фракции из

яда гюрзы в дайной системе является уникальным.

Пептидную фракцию Х яда гюрзы с мол.м. 1000-1300 получают из последней гель-фильтрационной фракции олигопептидов яда гюрзы на сефадек- се Г-100 (мол.м, не более 2000 - 3000), которая является отходом выделения ряда чистых биоактивных белков из яда и до сих пор не находит исполь.зования, что следует учесть при оценке стоимости стабилизирующего ингредиента. Для выделения фракции с мол.м, 1000 - 1300 проводят гель-фильтрацию вьвпеуказан- ной Х фракции яда на сефадексе Г-15 в растворе 0,2 М уксусно-кисло- го аммония, рН 6,5 (2,2 х 200 см колонка). Вьщеление фракции с мол.м, 1000-1300 является простым одноэтап- ным процессом гель-фильтрации на сефадексе Г-15. Полученный стабилизатор фермента не содержит свободных L-аминокислот-субстратов оксидазы L-аминокислот, так как не является субстратом фермента.

Таким образом, технико-экономическая эффективность использования предлагаемого способа выражается в возможности получения лиофильно высушен ного препарата L-аминокислот из яда гюрзы, обладающего высокой актив

Способ лиофильного оксидазы L-аминокисло заключающийся в добав ному раствору, содерж фермент, стабилизатор лиофилизации отли тем, что, с целью пов по активности оксидаз используют буферный р вши 2-5 мг исходного а в качестве стабилиз полученную с помощью ции пептидную фракцию мол.м, 1000-1300 даль бавляют при весовом с мент-стабилизатор от

ностью - 6-9 ед/мг белка, по меньшей

I

Остаточная активность оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы после лио4 шьного высущивания из раствора

Глицин

и К

II

O

5

0

5

мере в два раза превышающей активность имеющихся на мировом рынке лио- . филизованных препаратов этого фермента и отчасти превышающей даже активности наилучших препаратов, предла- гаемытс в виде растворов. При этом выход при лиофилизации достигает 96,8-100%, что значительно превышает выход при лиофилизации известными способами (70-85%), Важной особенностью способа является использование в качестве стабилизатора инерт- ной добавки, являющейся отходом при получении фермента из яда.

-

Формула изобретения

Способ лиофильного высушивания оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, заключающийся в добавлении к буферному раствору, содержащему исходный фермент, стабилизатора и последующей лиофилизации отличающийся тем, что, с целью повышения выхода по активности оксидазы L-аминокислот, используют буферный раствор, содержавши 2-5 мг исходного фермента в I мл, а в качестве стабилизатора применяют полученную с помощью гель-фильтрации пептидную фракцию яда гюрзы с мол.м, 1000-1300 дальтон, которую добавляют при весовом соотношении фермент-стабилизатор от 7:1 до 5:1,

53,6 54,3 70,3 70,0 73,1 73,0

Продолжение таблицы

I6A Альбумин (СССР мол.м. 5:1 67000)

13078498

Продолжение таблицм

52,8

Изобретение относится к ферментной промьнопенности. Цель изобретения - увеличение выхода по активности при лиофилизации оксидазы L-ймино- кислот. Лиофильное высушивание оксн- дазы проводят из замороженного 0,01 - 0,03 М раствора уксусно-кислого аммония с концентрацией фермента 2 -г 5 мг/мл, рН 5,5-9,0 с добавкой фракций яда гюрзы с мол.м. 1000-1300 дальтон при весовом соотногаенин от 17:1 до 5:1 между оксидазой L-амино- кислот н стабилизатором соответствен- но. Фракцию стабилизатора Получают методом гель-4 1пьтрации.Стабилизация активности фермента во время лиофилизации составляет 96-100%. Активность препарата оксидазы L-аминокис- лот после лиофилизации 6-9 ед/мг белка. I табл. g 00 о 00