Штамм культивируемых гибридных клеток ВСКК (п) N2Д-продуцент моноклональных антител к гормону роста человека Советский патент 1986 года по МПК A61B10/00 C12N5/00 

Изобретение относится к HMMyHojro- гии, в частности к получению клеточных гибридов, секретирующих антитела определенной специфичности.

Цель изобретения - получение штам ма гибридомы, секретярующего монокло нальные антитела к гормону роста человека. В результате свойства слияния клеток перевиваемой мьшшной миеломы Х-63 АГ8653 и лимфоцитов се- лезенки мыши BALB/c получают штамм гибридомы ВС КК/П/ № 2Д, синтезирующий антитела искомой специфичности.

Морфологические свойства. Клетки kмeют округлую форму, ядро занимает большую часть клетки. Форма ядра ок- руглая, иногда лопасная. Цитоплазма ободком окружает ядро. Клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно.

Физиологические свойства. При суспензионном культивировании на среде RPMI или DMEM с эмбриональной телячьей сывороткой и гентамихщном клетки дают миеломньй рост. Клетки перевиваются мышам линии BALB/c, продуцируют иммуноглобулины мьши. .Модельное число хромосом-40,5 (около тетраллоидное), выявляются мышечные акроцентрики.

Получение гибридомы.

а) Иммунизация.

Мьшам линии BaLB/c с массой 15- 17 г (у) вводят гормон роста человека по 600 мкг на мьшь в 6 приемов (в первые 5 приемов с полным адьюван том Фрейнда, в последний: - без него) : в стопы задних ног по 50 мкг в каждую, через 3 дня - в стопы передних ног по 50 мкг в каждую, через 4 дня - в плечи подкожно по 50 мкг в каждое, через 7 дней - инте |аперитонеально - 100 мкг, через 10 дней - интреперитонеально - ГООмкг за 3 дня до слияния внутривенно - 100 мкг.

Слияние клеток в суспензии осуществляют с помощью 50%-ного раствора ПЭГ с мол.мае. 4000 на среде RPMI. 1 MJI ПЭГ наносят в течение 1 мин на

а

влажный осадок клеток (10. клеток селезенки и 10 клеток миеломы),, осторожно покачивая пробирку (при ), и инкубируют затем 1,5 мин. Добавляют 1 мл теплового раствора Хенкса и инкубируют 30. с, затем добавляют еще 3 мл теплового раствора Хенкса и инкубируют 1 мин, доливают

раствор Хнкса до 50 мл и инкубирукгг 5 мин.

б) Селекция гибридов.

После окончания процедуры слияния клетки высаживают в ячейки 24-ячееч- ных пластиковых культуральных плат, на которые за сутки до этого высаживают мьшшные перитонеальные клетки (100 тыс. перитонеальных-клеток, 100 тыс. клеток миеломы, 1 млн. клеток селезенки на ячейку). Селекцию проводят на среде ГАТ, приготовленной на.основе среды RPMI с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 мМ буфера Hepes (Good N.E. etal 1966, Biochem 5,467-477) и 40 мкг/МП антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в термостате с поддувом углекислоты (5-7,5% углекислоты) . Клоны гибридных клеток появляются через неделю.

Продукцию антител к гормону роста в первичных культурах гибридных клеток определяют, проверяя наличие ан- гител в культуральной среде по методу ELISA на гибких полихлорвиниловых платах с использованием меченых пе- роксидазой кроличьих антител к мьшш- ным иммуноглобулинам.

Дальнейшее клонирование осуществляют методом предельного разведения /1 клетка на ячейку/ в 96-ячеечных пластиковых культуральных платах с питающим слоем перитонеальных клеток.

Культуру прививают и выращивают в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALB/C. За 7 дней до введения Клеток мьшам - реципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 2-3 недели после введения 1-5 млн клеток.

Очистка антител из асцитической жидкости.

Перед очисткой антител асцитичес- кую жидкость размораживают в водяной бане и центрифугируют при 4000 об/мин на центрифуге 25-658 (ротор SW 65). Осадок отбрасывают, а супернатант используют в дальнейшей работе. Определяют оптическую плотность супернатан- та при 280 нм. С этой целью к 3,4 мл супернатанта (24,2 мг белка на 1 мл) добав-пяют 6,4 мл буфера А. Далее проводят фракционирование сульфатом аммония. К 8,15 мл раствора белка добавляют 7,34 мл насьщенного при комнатной температуре раствора сульфата аммония. Смесь перемешивают на

3

40

мин и оставляют

холоде в течение при на ночь. Осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин на центрифуге К-24, растворяют в 0,3 мл буфера Б (0,02 М трис-НС1, 0,04 М NaCl, рН 7,9) и диализуют против 150 об.буфера Б.

Отдиализованный раствор наносят на колонку (3,5 см/0,85 см ) сДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной буфером Б. Колонку промывают буфером Б до полного выхода белка, не связанного ионнообменником.

Антитела к гормону роста человек выходят при этом одним пиком, что :показано путем связьшания антител с иммобилизированным гормоном и ана1223445

лизом препарата в электрофорезе в денатурирукнцем геле полиакриламида.

Выход очищенного препарата антител составил по белку 3,4-9,2%, а титр антител 2,5 10 - 10 , в то время как по прототипу титр антител равен 10 .

Продуцируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела могут быть использованы при выявлении гормона роста человека в медицинских и генно-инженерных исследованиях, очистке гормона роста человека, полученного генно-инженерным способом иммунофер- ментным методом, показано связывание антител с гормоном, полученным этим способом.

Штамм культивируемых гибридных клеток ВСКК(П) 2Д (хранится в коллекции Института цитологии АН СССР под номером 2Д) - продуцент монокло- нальньк антител к гормону роста че- ловека.