1
Изобретение относится к получению биологически активных вешеств, в частности к способу получения 5- (2,2,2-трифторэтил)-гуани- дин -пиразол-1-илу-валерамида, яв- ляюшегося антагонистом гистамина Н-2 и ингибирующего секрецию кислоты желудочного сока.
Известно, что физиологически активное соединение гистамин, который образуется в организме животных способен в процессе проявления его активности соединяться с некоторыми специфическими рецепторами, из которых известны по меньшей мере два определенных и отличных один от другого типа. Первый носит название рецептор Н-1, и действие гистамина на данный рецептор блокируется (ан- тагонизируется) классическими анти- гистаминовыми лекарствами, такими как мепирамин. Второй рецептор гистамина носит название рецептор Н-2, и действие гистамина на данный ре- цептор блокируется такими лекарствами, как циметидин. Одним из результатов блокирования действия гистамина на рецептор Н-2 является инги- бирование секреции кислоты желудочнго сока, и соединение, обладающее такой способностью, находит применение для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и других заболеваний, вызванных раздражением за счет желудочной кислотности,.
Цель изобретения - разработка способа получения нового соединения являющегося активным антагонистом гистамина Н-2 и сильно ингибирующег секрецию кислоты желудочного сока,,
Пример. (2,2,2-Tpи- фтopэтил)-гyaнидинo -пиразол-1-ил - валеронитрил (13 г) добавляют в течение 10 мин к концентрированной сеной кислоте (65 мл) при одновременном перемешивании. Полученный раствор поддерживают при 20 С в течение 18 ч и затем разбавляют льдом (300м и подщелачивают с помощью 10,8 н. гидрата окиси натрия ,до достижения рН 9. Смесь экстрагируют этилацета- том (3x200 мл), зкстракт высушиваю (над сульфатом магния) и выпаривают в вакууме до получения в остатке масла, которое кристаллизуется. Сырой продукт перекристаллизовывают и EtOAc, в результате чего получают
10
15
337992
7,2 г 5-13- 2-(2,2,2-трифторзтил)- гуанидино -пиразол-1-ил -валерамид, т. шт. 13Ь°С. ЯМР-спектр (d DMCO): 7,4 (d, IH); 5,65 (d, I H), 4,0 (m, 5 4H); 2,1 (t, 2 H); 2,6 (m, 4H).
Исходный м;,.териал получают следующим образом.
Гидрид натрия в виде пастообразной массы (6,16 г 61 мас.%-ной суспензии в жидком парафине) вводят отдельными порциями в течение 30 мин в раствор 3-нитропиразола (17,4 г) в обезвоженном диметилформамиде (150 мл) с внешним охлаждением льдом с целью поддержания температуры раствора 20-30 0. Смесь перемешивают в течение 45 мин и к почти прозрачному раствору добавляют 5-бромвалеронитрил (25 г) в течение 30 мин при 25-30 0, затем смесь перемешивают в течение 4 ч. Добавляют воду (450 мл) и EtOAc (450 мл), верхний слой отделяют, высушивают (над MgS04) и вьтари- вают в вакууме до получения в остатке масла, которое представляет собой смесь 5-(З-нитропиразол-2-ил)-валеро- нитрила и 5-(5-нитропиразол- -ил)-ва- леро штрила. Это масло разделяют на две (по 15 г) порции, которые фракци- - онируют, пропуская их через колонку с силикагелем (диаметр 3,5 см, длина 100 см). Элюирование осуществляется
20
25
при давлении 2 атм смесью этилацетат- петролейный эфир (т. кип. 60-80 С)
в соотношении 3:7 (об.). Сначала элю- ируется 3:5 изомер, а затем 1:3 изомер. Получаемый 5-(3-нитропиразол- -1-ил)-валеронитрил имеет т. пл. 32- 33° С.
К раствору 5-(3-нитропиразол- - -ил)-в,алеронитрила (3,16 г) в обезвоженном тетрагидрофуране (200 мл) добавляют палладий (5%) на угле (1,8 г). Смесь перемешивают при 20 С
в атмосфере водорода. В течение 4 ч абсорбируется 3,2 л водорода. Ката- лиз,атор отфильтровывают , фильтрат вьтаривают в вакууме, в результате чего получается 5-(3-аминопиразол- 1-ил)-валеронитрил в виде масла. В раствор 5-(3-аминопиразол-1 ил)-валеронитрила (7,0 г) в ацето- нутриле (25 мл) вводят 2,2,2-трифтор- этилизотиоцианат (6,02 г). Спустя
15 мин растворитель выпаривают в
вакууме, в результате чего получается 5-|3- 3-(2,2,2-трифторэтил)- тиоуроидо -пиразол-1 -ил -валерснитрил в виде белого кристаллического твердого.вещества, т. пл, 96-98 С.
Указанную тиомочевйну (12,5 г) растворяют в 8 М растворе аммиака в EtOH (120 мл). К раствору добавляют окись ртути (12,8 г) и смесь перемешивают при 20 С в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют, фильтрат вьшаривают в вакууме, в результате чего получается (2,2,2-три- фторэтил)-гуанидино -пиразол-1-ил - валеронитрил В виде масла. Образец этого масла растворяют в ацетоне и добавляют 5 М эквиваленты малеиновой кислоты. К образующемуся прозрачному раствору добавляют диэтиловый эфир, в результате чего получается кристаллический малеат, т. пл. 123-125 С
Кроме того, (2,2,2-трифтор этил)-гуанидино -пиразол-1-ил -вале- ронитрил может быть получен в результате реакции 3-аминопиразола с 2,2,2-триф горэтилизотиоцианатом, реакции полученной тиомочевины с аммиаком в присутствии окиси ртути и ал- килирования у атома азота в -м по- ложении 3- 2-(2,2,2-тpифtopэтил)- -гуанидино -пиразола с 5-бромвалеро- нитрилом.
Активность антагониста гистамина Н-2,может быть продемонстрирована посредством стандартных испытаний предложенного соединения ингибиро- вать вызванную гистамином положительную хронотропную ответную реакцию при спонтанном биении правого предсердия морских свинок или по способности этого соединения ингибировать вызванное гистамином поглощение ами- нопирина в кислотное пространство париетальных клеток (т.е. обкладочных клеток желез желудка). I
Испытания на морских свинках осуществляют следующим образом.
Правое предсердие морской свинки подвешивают с натяжением 1 г (изометрическое натяжение) в тканевой ванне с термостатическим регулированием (80°С) емкостью 25 мм, содержащей насьщенный кислородом (95% 0 5% СО) буфер Krebs-Hehseteit (рН7,4) Ткань стабилизируют в течение 1 ч, и в течение этого времени ее промывают 2-4 раза. Отдельные сокращения регистрируют посредством датчика силового смещения с использованием измерителя деформации, мгновенные частоты сокращения регистрируют пос33799
редством кардиотахометра. Получают значение контрольной ответной реакции на 1 мкмоль гистамина, после чего ткань промьшают три раза и снова 5 приводят в равновесное состояние до основного показателя частоты. После установления равновесия, длящегося 15 мин, вводят испытываемое соединение по желаемой конечной концент- 10 рации. Через 10 мин после введения соединения снова вводят гистамин (1 мкмоль) и ответную реакцию на гистамин в присутствии антагониста сравнивают с контрольной ответной )5 реакцией на гистамин. Результат выражен в процентах от контрольной реакции на гистамин. После этого стандартными методами определяют кажущуюся константу диссоциации антагонис- 20 та гистамина Н-2.
Испытание с -аминопропином осуще- . ствляют следующим образом.
Удаляют слизистую оболочку желудка из мышц дна желудка и промывают 25 ее в буфере 1 (содержащем 1 л раствора, г: NaCi 8,007; КСГ 0,201; 0,113; KHjPO 0,204; CaC E - 0,132; MgCl 0,101; глюкоза 1 с регулированием рН до 7,4 посредством 3Q NaOH). Ткань тонко измельчают, суспензируют в буфере и промывают три раза буфером 1. Затем ткань суспензируют в -диспергирующей среде (Кол- лагеназа (Sigma Chemical Со Тип У; 100 мг) и альбумин коровьей сыворот- ки (Mibs habaratories Ltd, фракция-У; 00 мг (в 100 мл буфера 1) в количестве 50 мл на 10 г чистого веса ткани, и термостатируют при 30 С и рН 7,4 (поддерживается путем непрерывного регулирования) при перемешивании в атмосфере кислорода. Через несколько минут ткани дают возможность осесть и поверхностный жидкостный слой удаляют. Вводят свежую .порцию диспергирующей среды и продолжают термостатирование с использованием ткани, которая в большей своей части диспергируется в железы и целые клетки через 40-60 мин. Оставшиеся большие кусочки ткани удаляют путем фильтрации через нейлоновую сетку.
45
50
Смесь желез и клеток центрифуги- руют при 200 g и суспензируют в буфере 1, содержащем 1% альбумина коровьей сьгооротки (Miles Laboratories Ltd, Фракция У). Затем железы и клетки промывают три раза буфером 1 и суспензируют в буфере 2, содержащем lagb MEM (500 мл), Апротин (Sigma Chemical Со, 10 мг) и HEPES (т.е. (2-оксиэтил) пиперазин-1-ил этансульфокислоты ; 150ммоль; 20мл), при поддержании рН 7,4 посредством NaOH (150 мл на 10 г чистого веса ткани). Эту тканевую суспензию перемешивают в атмосфере кислорода при 32°С в течение по меньшей мере i ч, после чего ее можно использовать.
Тканевую суспензию термостатируют вместе с испытуемым соединением и аминопирином (10 мкмоль), меченым С в диметиламиновой группе (0,1 мк- ), в течение 20 мин. Затем поглощение амидопирина стимулируют путем добавления гистамина и ингибитора фосфодиэстеразы ICI 63197 до конечных концентраций 10 и 5х10 мо ля соответственно. По истечении I8 мин клетки/железы извлекают из термостатированной среды путем фильтрации суспензии через стеклянный микрофибрильный фильтр. Клетки / железы быстро (в течение менее чем 10 с) промывают три раза буфером 1, охлажденным льдом. Аминоп ирин, меченый с , удерживаемый тканью, измеряют с помощью сцйнтилляционного счетчика и степень ингибирования поглощения испытьгоаемым соединением рассчитьгеают путем сопоставления с контрольным образцом. Затем с помо- щью графиков, полученных в ряде испытаний, проводимых при различных концентрациях, рассчитьгеают концентрацию испытуемого соединения, дающую ингибирование на 50%.
Предлагаемое соединение испытывают либо в экспериментах с предсердием морских свинок, либо в экспериментах с аминопирином. Это соединение, подвергнутое испытанию в экспериментах с предсердием морских свинок, является активным и при концентрации в тканевой ванне 10 мкмоль или ниже показывает полное ингибирование ответной реакции при этой концентрации. Все соединения, подвергнутые испытанию в экспериментах с аминопирином, показывают 50%-ное ингибирование поглощения аминопири- дина при концентрации 3 мкмоль или менее.
Ингибирование секреции кислоты желудочного сока демонстрируют стандартными испытаниями, например по способности соединения при вводе его путем внутривенной инъекции, через желудок или через рот, ингибировать секрецию кислотного желудочного сока, например, у крыс или собак, у
которьгк имеется желудочный свищ или денервированные углубления дна желудка и у которых секреция желудочного сока стимулируется путем ввода секретогенного агента,, например гистамина, пентагастрина, бета- нехола или пищи.
Испытание на крысах проводят следующим образом .
Самок крыс (весом 200-230 г) анестезируют путем внутримьшечного ввода уретана (1,5 г/кг), в трахею вводят полую, хирургическую иглу. Гибкую трубку пропускают через пищевод в желудок и укрепляют ее путем стягивания в области щей. Многодырочную пластмассовую трубку (диаметром 3мм) пропускают в полостную зону желудка через надрез в двенадцатиперстной кишке и закрепляют, привязывая ее
посредством хирургической нити к
привратнику желудка. Солевой раствор (9 г/л NaCi) пропускают через желудок (посредством вставленной в пищевод полой иглы) со скоростью 7 мл/мин, извлекают его из пилори- ческого отвода через каждые 10 мин и собирают в химических стаканах. Секрецию кислоты стимулируют путем подкожного ввода специфического агониста Н-2 димаприта, вводимого дозой 10 мг/кг, с последующим вливанием 30 мг/кг.ч. Выделение кислоты рассчитывают путем титрования 20 ммоль гидрата, окиси натрия 10-минутных
образцов до конечного значения рН 6,4 (выделяемых в течение 10 мин).
Когда секреция достигает постоянного значения (плато на-кривой - три последовательных показания с расхождением в пределах 5%), испытуемое соединение вводится путем внутривенной инъекции через полую иглу, введенную в левую наружную яремную вену. Затем измеряют секрецию в течение последующих 2 ч. Приготавливают основной раствор каждого испытуемого соединения (10 мг/мл в диметилсуль- фоксиде) VI разбавляют соответствующим образом солевым раствором, так
чтобы обеспечивалась возможность ввода в организм дозы 1 мг/кг (ди- метилсульфоксид - 2%) .
Испытание на собаках с хроническим свищом осушествляют следующим образом.,
Испытания проводят на самках собак чистой бельгийской породы весом 9-12 кг, имеющих хронический желудочный свиш. В течение ночи их не кормят и лишь при желании дают воду В ходе эксперимента собаки находятся в стоячем положении в слегка расслабленном состоянии. При вводе испытуемого соединения путем внутривенной инъекдии свищ открывается, и после полного убеждения в том, что базальная секреция не происходит в течение 30 мин, начинают осуществлят непрерьтное внутривенное вливание секретогенного агента (гистамина 0,5 мкмоль/кг- Ч или пентагастри- на 2 мкг/кг ч) в солевом растворе (15 мл/ч). Пробы желудочной кислоты собирают каждые 15 мин. Измеряют объем каждой пробы, 1-миллилитровую аликвотную пробу титруют до нейтральной 100 ммоль NaOH с целью определения концентрации кислоты. Когда достигается постоянная секреи я (плато кривой; 1-2 ч), путем внутривенной инъекции вводят испытуемое соединение в солевом растворе и про- бы кислоты желудочногЪ сока собирают в течение дальнейших 2- 3 ч, в ходе чего непрерьшно продолжается вливание секретогенного агента.
При исследовании испытуемого соединения путем внутрижелудочного ввода после полной убежденности в отсутствии базальной секреции в течение 30 мин испытуемое соединение, содержащееся в 25 мл 0,5%-ной (мае./об.) оксипропилметилцеллюлозы и 0,1%-ного (мае./об.) Твина 80 в воде, вливается по каплям в желудок через дозирующую пробку, вставленную в свищ. Спустя 1 ч свищ снова открывается, и тотчас начинается вливание секретогенного агента. Пробы кислоты желудочного сока измеряют и приближение секреции кислоты к постоянному значению сравнивают с приближением секреции кислоты к постоянному значению для контрольного животного, в организм которого вводят путем внутрижелудочного вливания лишь один носитель.
233799
При изучении испытуемого соединения, вводимого через рот, оно используется в форме желатиновых капсул вместе с 15 мл воды. Через 1 ч 5 после ввода свищ открывается, и
тотчас начинается внутривенное вливание секретогенного агента. Пробы желудочной кислоты измеряют и приближение секреции кислоты к постоян- 10 ному значению (к плато кривой) сравнивают с приближением секреции для контрольного животного, в которое не вводилось испытуемое соединение.
Испытание на собаках с денервиро- J5 ванным углублением дна желудка осуществляют следующим образом.
Испытания проводят на самках собак коротконогой гончей породы весом 14-22 кг. Денервированныеуглуб- 20 ления в области железы дна желудка у этих собак получаются при подго- . товке их к испытаниям способом Ru- dick и др. В течение 4-6 нед животные поправляются от операции, и в 25 дяльнейший период в течение 2-3 мес до обычного использования проводится подготовка таблиц и нормализация секреторных реакций. Собак не кормят в течение 23 ч перед экспериментом (по желанию дают воду) и в процессе эксперимента повязку, которой они перевязаны, расслабляют . После промывки углубления теплой водой путем подкожной инъекции вливают гистамин со скоростью 10 мкг/мин. Такая доза приводит к менее чем максимальному (60-90% от максимального) увеличению вьщеления кислоты при всех используемых дозах. Выделения желудочного сока из углубления собирают через каждые 15 мин в градуированные стеклянные пробирки и измеряют объем секреторных выделений, приближающийся в О, мл. Пробу в количестве 500 мкл разбавляют 5 мл соле- вого раствора и рН доводят до 7,0 с помощью 100 ммсль NaOH. Общее выделе- кие кислоты рассчитывают как произведение концентрации кислоты на объем выделенного желудочного сока. 50 Испытуемые соединения вводятся внутривенно (0,1 мл/кг) через лучевую подкожную вену или через рот в виде желатиновой капсулы после достижения постоянной секреции (расхождение в трех последовательных показаниях в пределах 10%). Секрецию измеряют в течение 3 ч после ввода испытуемого соединения.
30
35
40
55
9 1233799 10
Результаты, полученные при испы-сти или побочных эффектов данного
тании на предсердии и с использова-соединения.
нием минопирина, позволяют пред-В соответствии с указанной метосказать активность данных соедине-j дикой соединение, полученное предний. При испытаниях на собаках иложенным способом, активно в конценткрысах не обнаружено явной токсично-рации 0,0036мкМ,а известное 0,29мкМ.
