Способ определения активности лейцинаминотрансферазы Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к биохимии, и может быть использовано как J3 клинике, так и в эксперименте для определения активности L-лейцин: 2-оксоглутарат аминотрансферазы (КФ 2.6.1.6) в сыворотке или в плазме крови, моче, перитонеальной жяд- кости и в тканввых гомогенатах.

Цель изоб тения - ускорение спо- соба и определение активности L-лей- .цин-аминотрансфе рйзы (ЛАТ) в биоло- , жидкостях.

П.р и м е р 1. Берут навеску поделудочной железы 1 г, добавляют 9 мл натрийфосфатного буфера рН 7,8, получая таким образом 10%-ный гомо- гент. 0,2 мл гомогента.добавляют в инкубационную смесь, содержащую 25 MML-лейцина, 18 мМ od кeтoглyтa- ровой кислоты и 125 мМ пиридоксаль- осфата (общий объем инкубационной смеси 0,8 мл). Одновременно готовят контрольную пробу, содержащую все компоненты, кроме лейцина. Инкубацию опытной и контрольной проб проводят в термостате при 37°С 1 ч. Реакцию останавливают кипячением в течение 5 мин (эта операция не обязательна и выполняется при необходимости дальнейшего хранения проб). Затем добавляют 0,5 мл 0,020 раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 1н. НС1 и через.20 мин о5 мл 0,4 н. раствора едкого натра и через 10 минут фотометрируют при длине волны 510 нм против холостой пробы, содержащей 0,8 мл диcтиллиpoвaнi oй воды, 0,5 мл 0,02%-ного раствора 2,4-динитрофенил- гидразина и 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра. Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по пировиноградной кислоте. Алстивность J1AT определяют по формуле А(С,--С2)х ,,1, где А - активность ЛАТ в микромолях с -кетоизокапроновой кисло ты за 1 ч на I г ткани, С - количество пировиноградной кислоты, найденное по калибровочному графику в опытном образцеJ С2 - количество ровиноградной кислоты в контрольном образце; 50 - коэффициент пересчета на 1 г ткани; 1,1 - коэффициент пересчета от концентрации пировиноград- ной кислоты к концентрацииоС-кетоизо- капроновой кислоты, найденный эмпирически.

79762

В данном случае А (0,337-0,237)1 ,,5 мкмолей/г ткани/ч.

П р и м е р 2. Берут 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови человека, инку-

5 бируют в присутствии 25 мМ L-лейцина, 3 мМсх -кетоглутаровой кислоты и 125 нМ пиридоксальфосфата (общий объем пробы 0,7 мл) в натрийфосфат- ном буфере, рН 7,8 в термостате при

0 З7 с в течение 1 ч. Одновременно проводят инкубацию контрольной пробы, не содержащей лейцина. Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 0,02%-ного раствора 2,4-динитрофенилt5 гидразина в 1 н. НС1 (при необходимости хранения проб проводят предварительно кипячение в течение 5 мин), оставляют на 20 мин, затем добавляют 5 мл 0,4 н. раствора едкйго натра

20 и через 10 мин, фотометрируют при длине волны 510 нм против холостой пробы, содержащей 0,7 мл воды, 0,5 мл 0,020 раствора 2,4-динитрофенилги- дразина и 5 мл 0,4 н, раствора едко-

25 го натра. По э.кстинкциям из калибровочного графика, построенного по пировиноградной кислоте, находят -соответствующие концентрации пировиноградной кислоты и рассчитывают актив30 ность .ЛАТ по йюрмуле

A(C,-CS)- 10-1,1

где А - активность ЛАТ в микромолях оо кетоизокапроновой кислоты в 1 мл сыворотки (плаз- мы ) 3 а 1 ч;

С, вюличество пировиноградной

кислоты в микромолях, найденное для опытного образца; Су количество пировииоградной

кислоты в контрольном образце;

10 коэффициент пересчета на 1 Sin сыворотки (плазмы ); 1,1 - коэффициент пересчета от пировиноградной к oi кeтoизo- капроновой кислоте, найденной эмпирически. В данном случае A(0,285-0,240)i 1 О 1,1 0,495 микромолей о кетоизо- капроновой кислотыумл/ч.

П р и м е р 3. Берут мл мочи человека и проводят операции те же, что в примере 2, Расчет ведут по той же формуле, В данном случае А (0,223-0,201)10-1,,242 микромолей /мл /ч.

П р и м е. р 4. Берут 0,1 Nsn перитонеальной жидкости и проводят

те же операции, что и в примере 2, Расчет ведут по той же формуле.В данном случае А(0,345-0,200). IQi X1,,595 микромолей/мл/ч.

Формула изобретения

I, Способ определения активности лейцин-аминотрансферазы путем . инкубации ткани в присутствии L-лейцина, оС-кетоглутаровой кислоты и пиридоксальфосфата с последующим добавлением 2,4-динитрофенилгидразина и фотометрическим определением 2,4Составитель Н.Гуляева Редактор Н.Горват Техред Л.Сердюкова Корректор А.Зимокосов

Заказ 3283/45 Тираж 778Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород ул. Проектная, 4

237976

-динитрофенилгидразонов кетокислот, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, инкубацию проводят при рН 7,6-8,2, концен- 5 трации L -лейцина 20-30 мМ и et-кето- глутаровой кислоты 15-21 мМ,

2. Способ определения активное-, ти лейцин-аминотрансферазы по п, 1, отличающийся тем, что с целью определения активности фер-, мента в биологических жидкостях, инкубацию проводят при концентраций; 06-кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМ и пиридоксальфосфата.100-150 нМ,

10

Изобретение относится к биохимии и предназначено для определения активности L-лейцин-аминотрансферазы. Цель изобретения- - ускорение способа и определение активности I,-лей- цин-аминотрансферазы ЛАТ) в биологических жидкостях. Исследуемый материал помещают в смесь, содержащую- - 20-30 мМ L,-лейцина, 15-21 тоглутаровой кислоты и 100-150 нМ пиридоксальфосфата. Готовят еще контрольную пробу, содержащую все компоненты, кроме лейдина. Инкубацию проб проводят при рН 7,6-8,2 в течение 1ч. Затем добавляют раствор 2,4-динитрофенилгидразина в I н НС1 и через 20 мин раствор едкого натра. Через 10 мин фотометрируют. Расчет ведут по калибровочному графику, построенному по пировиноградной кислоте. По п. 2 ф.. инкубац1-по проводят при концентрации С кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМ и пиридоксальфосфата 100-150 нМ. i (Л t49 СО vl со Од