СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА C Российский патент 2004 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к химическим методам определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот при их совместном присутствии в биологическом материале. Изобретение может быть использовано в медицинских, ветеринарных и других биологических исследованиях при определении витамина С (аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты) и неактивного продукта его разрушения (дикетогулоновая кислота) в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях животных, а также для технологического контроля производства аскорбиновой кислоты.

Известен метод определения аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот в присутствии дикетогулоновой кислоты (С. F. Bourgeois, P.R. Mainguy / Internal. Journal Vit. and Nutr. Research, v. 44, p. 70-84). При определении аскорбиновой кислоты способ включает получение экстракта, пропускание его через колонку из сефадекса (анионит), окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую и элюирование последней с помощью раствора п-бензохинона, удаление избытка п-бензохинона экстракцией элюата хлороформом, обработку элюата колориметрическим реагентом - 4-нитро-1,2-фенилендиамином, удаление избытка реактива экстрацией этилацетатом, измерение оптической плотности продукта реакции при 375 нм. При определении суммы аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот присутствующую в экстракте из исследуемого материала дегидроаскорбиновую кислоту восстанавливают в аскорбиновую с помощью димеркапто-1,2-пропанола и, удалив избыток восстановителя экстракцией диэтиловым эфиром, дальнейший анализ ведут, как описано выше. Количество дегидроаскорбиновой кислоты определяют по разнице между суммой аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот и аскорбиновой кислотой.

К недостаткам способа относится его сложность и громоздкость. Постановка метода требует большого количества реагентов (23 наименования), в том числе дефицитных (димеркапто-1,2-пропанол, 4-нитро-1,2-фенилендиамин). Кроме того, способ не предусматривает определение дикетогулоновой кислоты, которая является продуктом деградации дегидроаскорбиновой кислоты и может характеризовать степень окислительности витамина С в исследуемом объекте.

Прототипом, наиболее близким предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату, является способ раздельного определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот (В.В.Соколовский, Л.В.Лебедева, Т.Е.Лиелуп /Лабораторное дело, 1974, N 3, стр. 160-162), основанный на способности дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в отличие от аскорбиновой кислоты реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием окрашенного озазона, а также на способности дегидроаскорбиновой кислоты в отличие от дикетогулоновой восстанавливаться в аскорбиновую кислоту под действием димеркаптопропансульфоната натрия. Метод состоит в раздельной экстракции образцов для определения аскорбиновой и суммы дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот (экстракция 5% раствором метафосфорной кислоты) и для определения дикетогулоновой кислоты (экстракция физраствором). При определении суммы аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот экстракт обрабатывают раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, при этом аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую. При определении суммы дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот экстракт действию окислителя не подвергают. Дикетогулоновую кислоту определяют, обработав экстракт раствором димеркаптопропансульфонатом натрия. После этого во всех случаях добавляют раствор 2,4-динитрофенилгидразина в разбавленной серной кислоте, содержащей тиомочевину, инкубируют и выпавшие кристаллы озазонов растворяют в 85% серной кислоте и фотометрируют при 520 нм. Полученных данных достаточно, чтобы рассчитать количество любой из определяемых кислот.

Недостатки метода состоят в том, что определение аскорбиновой кислоты и продуктов ее превращения ведется из разных навесок и различными методами экстракции. В качестве восстановителя применен малодоступный реагент - ди-меркаптопропансульфонат натрия.

Цель изобретения заключается в повышении точности определения дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот и доступности способа для широкого использования в практике.

Сущность изобретения состоит в применении в известном способе нового принципа раздельного определения дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот, основанного на резко различающейся скорости деградации этих кислот под действием раствора щелочи (NaOH). Специфичность метода состоит в том, что дикетогулоновая кислота после нейтрализации кислого экстракта пробы с помощью мела (СаСО₃), разрушается сразу после добавления щелочи (см. табл.1), а дегидроаскорбиновая гораздо позже. При этом между временем контакта едкого натра с дегидроаскорбиновой кислотой и количеством последней существует прямолинейная зависимость, позволяющая дифференцированно определить дикетогулоновую и дегидроаскорбиновую кислоты. Способ позволяет определить аскорбиновую кислоту и ее производные из одного и того же экстракта и не требует применения дефицитного реагента - димеркаптопропансульфоната.

Влияние реакции среды на эффективность определения метаболитов витамина С изучали, используя окисление стандарта аскорбиновой кислоты с помощью 0,03% раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола или с помощью раствора едкого натра, воздействуя на нейтрализованные мелом растворы (табл. 2).

Пример. Определение витамина С в траве клевера.

Образец травы клевера красного (5 г) помещают в фарфоровую ступку, куда приливают 95 мл 0,5% раствора соляной кислоты, и растирают в течение 5 мин. Затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, супернатант фильтруют через бумажный фильтр. Половину фильтрата (для пробирок 3-5) нейтрализуют мелом до прекращения выделения пузырьков газа. Берут 5 пробирок. Исследуемый раствор и реагенты добавляют строго в описанном порядке (после каждой операции пробирки встряхивают).

Пробирка 1

0,03% Раствор

2,6-дихлорфенолиндофенола 0,1 мл

2. 1.5% Раствор тиомочевины в 7,5%

растворе мета-фосфорной кислоты 1,5 мл

3. Исследуемый раствор (кислый) 2,0 мл

4. Вода 0,4 мл

Пробирка 2

1. Исследуемый раствор (кислый) 2,0 мл

2. 0.03% Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,1 мл

3. 1.5% Раствор тиомочевины в 7,5%

растворе мета-фосфорной кислоты 1,5 мл

4. Вода 0,4 мл

Пробирки 3, 4, 5

Исследуемый раствор

(нейтрализованный) 2,0 мл

2. 3.5% Раствор едкого натра 0,4 мл

Ровно через 5 мин

(пробирка 3), 20 мин

(пробирка 4) и

90 мин (пробирка 5) после

добавления щелочи

- 1,5% раствор

тиомочевины в 7,5%

растворе мета-фосфорной

кислоты 1,5 мл

0.03% Раствор

2,6-дихлорфенолиндофенола 0,1 мл

После этого во все пробирки приливают по 1 мл 2% раствора 2.4 динитрофенилгидразина в разбавленной серной кислоте (1 часть кислоты + 3 части воды) и инкубируют на водяной бане при 55°С в течение 1 часа. Пробирки охлаждают, выпавшие озазоны растворяют, добавив в каждую пробирку по 5 мл 85% серной (по каплям) или ледяной уксусной кислот. После центрифугирование супернатанты колориметрируют при 520 нм. Озазоны можно отэкстрагировать бензолом. Для этого после инкубации в каждую пробирку приливают по 5 мл бензола. Пробирки энергично встряхивают. Бензольный слой отделяют центрифугирование в течение 15 мин при 3000 об/мин и колориметрируют при 510 нм.

Параллельно ставят пробу на стандартный раствор аскорбиновой кислоты по принципу пробирок 2 и 5, но вместо исследуемого раствора вводят стандартный раствор аскорбиновой кислоты в 0,5% водном растворе соляной кислоты с концентрацией 20 мкг/мл.

Концентрации аскорбиновой (Сак), дегидроаскорбиновой (Сдак) и дикетогулоновой (Сдкгк) кислот рассчитывают по следующим формулам:

где D₁, D₂, D₃, D₄ - разница между оптической плотностью соответственно пробирок 1, 2, 3, 4 и оптической плотностью пробирки 5 (фон примесей);

D_ст - разница между оптической плотностью стандартного раствора аскорбиновой кислоты по варианту 2 и оптической плотностью пробирки 5 (фон примесей);

С_ст - концентрация аскорбиновой кислоты в стандартной растворе, мкг/мл (здесь 20);

V - объем раствора, взятого на анализ, мл (здесь 2);

t₁, t₂ - время после добавления раствора едкого натра (пробирки 3 и 4), мин (здесь 5 и 20);

R - разведение (здесь 50);

m - масса образца, г (здесь 5).

Сравнительные данные определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в траве клевера красного приведены в табл.3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что предлагаемый способ дает заметно более высокие результаты анализа дикетогулоновой кислоты как следствие более низкой экстракционной способности нейтрального экстрагента. При большой специфичности реакции 2,4-динитрофенилгидразина с кетонами повышенные количества метаболитов аскорбиновой кислоты, определяемые предлагаемым способом, явно свидетельствуют об его более высокой точности по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к химическим методам определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот при их совместном присутствии и может быть использовано при анализе кормов, пищевых продуктов, органов и тканей животных и других биологических объектов. Способ включает экстракцию пробы раствором соляной кислоты и количественное определение кислот по реакции с 2,4 динитрофенилгидразином. Количество дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в пробе определяют на части общего экстракта, нейтрализуемого мелом, по разнице в скорости разрушения их под действием едкого натра. Способ позволяет определить аскорбиновую кислоту и ее производные из одного и того же экстракта и основан на применении простых и широкодоступных реагентов. Способ также дает более высокие результаты, особенно при определении дикетогулоновой кислоты. 3 табл.

Способ определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот при их совместном присутствии в биологическом и химическом материале, включающий экстракцию пробы раствором соляной кислоты и количественное определение кислот по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в котором количество дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в пробе определяют на части общего экстракта, нейтрализуемого мелом, по разнице в скорости разрушения их под действием раствора едкого натра.