Способ определения сфингомиелина Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 G01N33/68 G01N33/92 

Изобретение относится к биологии, биотехнологии и медицине, в частности к, способам быстрого определения сфингомиелина в органах и тканях, в биологических продуктах и биологических жидкостях организма.

Цель изобретения - упрощение способа за счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон и последующего определения точки эквивалентности по гемолизу эритроцитов .

Способ осуществляется следующим образом.

К материалу, содержащему сфинго- миелин, доба:вляю1г белки-гемолизины из морских анемон, затем вносят зрит роциты и определяют точку эквивалент кости по появлению гемолиза зритрог

2Д2826

тов. Исходя из молекулярного веса используемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают со- 5 держание сфингомиелина.

Пример 1. В серии пробирок делают ряд разведений пробы (сыворотки крови человека), добавляют гемо10 лизин РТХ из морской актинии

Radianthtas macrodactylus (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл), смесь инкубируют 30 мин при комнат- ной температуре, затем во все про15 бирки добавляют по 1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Количественные соотношения сфингомиелина и гемолизина, а также последовательность операций приведены в табл.1.

|, Проба сыворот- ки, разведен-;

ная в 100 раз,

мкл

6,0 ,7,0. 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0

Физиологический

раствор, мкл 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0

Гемолизин РТХ,

мкм .20,0 20,.0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

Инкубация 30 мин

1%-ная суспензия эритроцитов, мл 1,0 1,0

Гемолиз

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Инкубация 5 мин + 4- +/

Из табл.1 видно, что точка эквивалентности наблюдается в пятой про-. бирке. В предыдущих четырех пробирках концентрация гемолизина избыточна для связывания со сфингомиелином пробы и наблюдается гемолиз тестовых эритроцитов. В пробирках 6-10 количества гемолизина недостаточно для связывания со сфингомиелином, что подтверзвдается отсутствием гемолиза тестовых эритроцитов.

Пример 1. В серии пробирок делают ряд разведений пробы (сыворотки крови человека), добавляют гемолизин РТХ из морской актинии

Radianthtas macrodactylus (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл), смесь инкубируют 30 мин при комнат- ной температуре, затем во все пробирки добавляют по 1 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Количественные соотношения сфингомиелина и гемолизина, а также последовательность операций приведены в табл.1.

. Таблица 1

1,0 1,0

Количество сфингомиелина в пробе расчитывается исходя из молекулярного веса гемолизина РТХ (16 000 ед.) и необходимого для взаимодействия соотношения гемолиз,ин-сфингомиелин (1-: 1) в молях по формуле

55

С -

см м7у

(1)

где Срд, - концентрация сфингомиелина в пробе, моль/л;

с г концентрация раствора ге молизина РТХ, г/л; . V - объем раствора гемолизина РТХ, л;

М - молекулярный вес гемолизина РТХ; VP - объем пробы, л.

Поскольку точка эквивалентности наблюдается в пятой пробирке, то С . 10- г/л; V л; У„ и С... 0,01 25 ммоль/л.

t М. , .

Так. как сыворотка разведена в 100 раз, концентрация сфингомиелина в ней составляет 0,012510 1,25 моль/ Если молекулярный вес сфингомиелина

Результаты титрования(гемолиз тестовых эритроцитов)

Сыворотка, разведенная в 100 раз, мкл3

Гемолизин (50 мкг/мл), мкл

Из табл.2 видно, что точка экви- 55тов. Концентрация сфингомиелина см, валентности наблюдается во всех слу-определенная по формуле (1), состав- чаях при одном и том же соотношенииляет для первой ячейки 4,1, для вто- специфически реагирукяцих компонен-рой 3,8, третьей, 4,1, четвертой

.

2428264

600, то его концентрация 1,2560(Г . 75 мг/100 мл.

Пример 2. В ячейки планшета однократного применения (для проведения серийного анализа сфингомиелина титрование можно вести в ячейках стандартного планшета для иммунологических реакций) раскапьгеают сег рию проб одной„ и той же разведенной в 100 раз сыворотки крови человека, добавляют гемолизин РТХ (исходная концентрация 50 мкг/мл), инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем во все ячейки добавляют 1%-ную суспензию эритроцитов. Соотношение компонентов и результаты титрования приведены в табл.2.

Таблица 2

10

15

+ /++ /( + /+

+

+ /4+

10

11

13 15

10 12

14

16

18

4,0, пятой 3,8, шестой 3,9 и седьмой 3,8 мкмоль/л. Средняя концентрация сфингомиелина С;, 3.92+0,13 мкмоль/л.

Пример 3. В серию пробирок с разведенной пробой (проба сыворотки человека та же, что и в примере 1) добавляют гемолизин из актинии

Проба сыворотки, разведенная в 100 раз, мкл 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

Физиологический раствор, мкл 9,0 7s,0 5,0 3,0 1,0

Гемолизин из актинии

S.helianthus, мкл . 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

Инкубация гемолизина со сфингомелином 30 мин.

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 + + +/Количество сфингомиелина. в пробе рассчитывается исходя из молекулярной массы гемолизина из актинии S. helianthus 16000 и эквимолярного взаимодействия гемолизина со сфинго- миелином по формуле (1),

Поскольку точка эквявалентности наблюдается в третьей пробирке, то

V, 2.1СГ л: V

г и с

и С г/

см

0,0125 ммоль/л. Так как сыворотка разведена в 100 раз и концентрация сфингомиелина равна 600, то ,С О.,0125-100600 75 кг/10 ми, что соответствует концентрации сфинРедактор А.Шишкина

Составитель Н.Гуляева

Техред (}„Сопка Корректор В.Бутяга

3697/42

Тираж 778 Подписное ВНИППИ Государственного комитета СССР

по лелам изобретений и открытий 113035, Москва, №-35, Раушская наб,, д„4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул,Проектная, 4

Stoichactis helianthus (20 мкл, исходная концентрация 100 мкг/мл), смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре, а затем во все про бирки добавляют по пензии эритроцитов ведены в табл.З.

мл 1%-ной сус- Результаты приТаблица 3

гo иeликaэ определенной с помощью гемолизина РТХ

Формула изобретения Способ определения сфингомиелина путем проведения специфической реакции со сфингомиелином пробы биологического материала, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, сфингомиелин титруют белками-томолизинами морских анемон, затем Добавляют эритроциты, определяют точ:ку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов и рассчитывают содержание сфингомиелина.

Изобретение относится к способу определения сфингомиелина. Цель изобретения - упрощение способа за. счет титрования сфингомиелина белками-гемолизинами морских анемон. К исследуемому материалу добавляют белки- гемолизины из морских анемон. Добавляют эритроциты. Определяют точку эквивалентности по появлению гемолиза эритроцитов. Исходя из молекулярной массы используемого гемолизина, его концентрации, объема раствора гемолизина и объема пробы, рассчитывают содержания сфингомиелина. 3 табл. с (О O 00 N9