Способ получения и-РНК для специфической иммунотерапии и профилактики Советский патент 1986 года по МПК A61K38/16 A61K45/06 

Изобретение относится к иммуисг терапииэ а также аз тквной иммуияза- 1ДИИ к гюлл ченюп антисыворото х в челствека и животньт.

Цель изобретения - получение и-РП ч специфического действии 11 5отив аити- г епов, iiepenoci-rvioft человеком при ::1римене: и-т, в частности при -п ъекпии,

CrtocoD ос5 П1ест влястся следующим эбрагюм.

Из гомо1 енл 1 а ткани селезенки приготавливают емест и-; и К нуклпсгги- ,п,ов и nyKj ieasnbie фермепч ы 1ли стиму- пяции иммунной системы,, опрабат :. эту смесь BiTpycHbiM, бактериальны ; игт опухо.чевым антигенами экстрагируют и-РНК 1%-иым зрдпым раствопом /i.( цгшсульфата натрия и 1%-ным раствором гренола, с целью очистки и РНР центрифугируют в г радиелте плотности х, рида цезия / сахарозы и тройнш о бус) ного растгзора при 130 000 д.

Эндонуклеазные феркелть ::олуч/1 от из селсзеиочного гомо еиата центрифуг ир о в анлем 3 градиенте нлотлостт сахарозы ари 100 000 Р; .

Пример. Ло Получение фер . ной системы.

Для получения соответствующей ферментной системы можно нсио.чьзон.-: :

лейкоциты и лимфоциты. Особенно г ч

способ получен1- я из селезенки. С. зтс . целью 1-2 г свежей быстрозаморожен-- ; селезенки (например, селезенки сч-ги- ней) размельчают в ступке в порои:ок с cjnciiivi льдом и жидкиг.; азотом. Порошок вводят в 1,5 мл трокног о буфер- ного раствора А в иробирке для неп г- рифуги и замора кивают суспекзтпо HIJI-I -70 С. Этот процесс повторяют ок-о-ло 10 раз. После этого подготовленные для обработки клетки отцентрид уп-фуугп в течение 30 мин в ультрацелтрифуг е Бекмана в роторе SW 50.1 при 30 dC ; р После центрифугирования отбирают 1-1,5 мл красного осветленного па;:..о-- садка и приводят на периодиггеский градиент сахарозы. Этот градиент сог тоит из 1 мл 60%-ной сахарозы в троГг ном буферном растворе A.j над KOTc piiu--: находятся 2,75 мл 30%-ного раств;)рг сахарозы в тройном буферном .растгк.:- ре А. Центрнфугироваьи-те ПРОБОЛЯТ Б ультрацектрифуге Кекмана, раствор vn 50,1, при 100 ООП R, 0°С. Через /: : получают необходимую фг. акцию в ni::c красноватого осветленн-го слоя raj;

iiV ;. )й саха.розой, ( лей отбирают iipi/. 1ва-.)-1тпльно охлажденной; н;-5Г еткой

1 -зазб.ззляю:- с oxj a5K4rHHh:H тройным Ука|)11:-,1м расггворсм А. Р с:о(:- ;о- 1е} ии

: I ., Раствор ;ч)Х;.;/п:): Т; :: жид-- х;;-- ;:з-)ге,

Ь. .МК (дезоксир - -ст1уклеинопая л -сн:} ) 3 включая и-ДИК (ннформаци ;: л: ii ;:3o;ccHpH6oHyj-. И1ювая кисло а,

i- г быст рсз 1мороже1 ной селезенки с; : 1заняемой з азоте, ; едленно оттаива- ic i 3 5 .мл Т К) нсго иус;ернс:гч:1 ра::тво- ПГ-. Л :-; г С1-.:о; С iiiJ3;-ipyi ; н гс:-; :г енияа .;о:;е ::осред.; гвом окс/Н К; Л31 . Kri,. Суспензию подают пс ка.пллм н vro/ioy )р: енмейер -: :0 мл ;--.iy: ,::;iH

.5и, г . ее е нселсд.-ти -1лирован-- .: : ,beM;:j: 4v ,- ;-пзгч:in-ie 1: )- после -..-; -;i 4 5 :::v :;J(j;;;,e -с ;: ля .: :; icrnui Г О --;.)ГСHiioi С -:iacлрелеЛ1; Hi-ги ..

|-:- ;::: iniKON:. :;я--м ой ;:-, ;-- г-;и):;.- о ;тсСав- ..) Г:. раствор позаренной со.г;и. 4 р; з /- - 1 ;полоч :о- -му | ную .си;с с 3 -г;и:.Ьу Л5руют н :де|| г-)ифу); .г 3 тече11ие

i --;и}: и;:1И /00(.) Дг ири зтом разделя- лве фазьь Бсгдную верхнюк; фазу разбавляют так1Пч же объемом (+10%) -3e;e;ofi ioi o этанола, так что Д}И( выпа- .::,,1, ; л -u:aj:;3K. ДНК рокалеыюй тигати :: ;1Й П ре НОСИ - СЯ В 10 Mj; с pi, -ик; ; ( 5 8.) )астворя хлорида н -рия. ДoбaйJ::-llol и спетила-ут мл

: --H:-IL: суоПлрата iu-TT;.nj,or,c- ;,.:, ;:, v Mj; 0.05 мозх/л I pi vpMci ( ряетi;i-;-;i /V v О О ) i--:oj:b/,:i буферпогс раст- R pa при оН 7,Р -- / KJ- т; J-()

M,i К, Растворение и::итс Я сколо , : си с дня, после :- ;ч;1 :; ае М(ж.;;о 1. е(,-иа оса;1:ить с (ь( cju-pv; о Ps; T- зг-;ччи-:е и ,;i.eii:-4: , . .яд- - - овтс;- рзн-г :i -7 раз, лока , ;:. ;.:::;.-IP;: ке v,,, к -,,, coc i ai rr . } .., -, . ijXpoM- нмР зфсЬек-/ не cec raiii-rf ; л.. ;:-: :л -р.с . -.т зличе ; 11Я . очф:-;IL--i;/) . эк- I 1,1:кг;;--.и :-:ри 2ЪО , /i:U:fipo ::yi ЙН :e,Ci /К )м, (ч ;(: тавл5--: :цая - ,й , : : -1Гнизитс тьис соо Г ; - сгруе i;; inieHT- ci-i . и iUf/МЛ. с; 01 1Ч ШС ;ТИеМ

Р . ли:р 4; iK разбавлен дг глкой i; е- н( Л чают ко11иентра11ию 1 ,- мл

В, Скнт сз и-;-НК - инфг-р;.;а:;и(

р:; о 1-у К.:(::ИПО1 ОЙ КИСле- 11) .

и ) Лпнс :;и льдом т rp-ofiHcf гу;Ьср- |)ЯС Н1С з ; с Р ; - 0 ; - if л 3 пякл

очищенную ;iy;j с .псч1 :;у; ,.:,;.: : а также смесь нуклеотилов АТФ 1 ,. 1СГФ н ТФ. Лля контроля г оставл,ч:;;т меньшую смесь с олинаковым количегт- венным соотногаенлемS н которую . ляют ТФ, маркированный тритиег-:. Закапывают всегда охлажденной пипот ;,- , Оптимальные концентрат ии отдельных компонентов определяют поср-здстпо; - нескольких опытов Каждую из проб инкубируют в водяной ванне при 37 С и уже через 3-6 мин разбавляют подн :: - раствором 1%-ного сульфата додеи1:-ла и 1%-ного фенола водного. Опти. юльнс-а время инкубирования также зависит от концентраций и соответствующего антигена и может быть определено яа - вании нескольких опытов. Ох;1аждс-п:1- проводят в ванне со льдом, иелтрг:::,у - гиругот при 2000 g, Надосадок . ; ;; , син тезированную сырую и-PliK.

Г, Очистка и-РИК. Из надое ; ,; . и-РНК изолируют по периодиги скому :-рг; диенту хлорид цезия/сахароза. .; ля этого в центрифужно1 трубке из а ;с - тилцеллюлозы наслаивают по 1 мл р;ь;; г- - вора хлорида цезия, плотность g 1,9 г/мл, с 0,75 мл 30%-ного раствора в тройном буферном растворе Л с рН 8,0. По 2 мл проб добагзтгяют Р. градиент и трубки закрывают стерильь; ;1: парафином. После центрифугирования при 18°С 130 000 g в течение . ч центрифуге Бекмана с ротором SVI 50, забирают слой хлорида цезия. /Шл „ цели центрифужнЕ)1е трубки прокалываю на дне прокаленной иглой и весь раствор хлорида цезия переводят в трубки до слоя сахарозы. Получениями .-; образом раствор разбавляют стертшыюй ,j водой в соотношенрп 1 :2 и сохр-пняют 4;v- мороженш гм при-20 С, седиментируя ч

CocTaBi-iTfijUi Н. Кузенксва Редактор С, ПатрушеваТехред ИЛТолопичКоп)нл то1Заказ 4027/59

пл rivViHiiiijT ; г Н гг: рп c j Bo/i. i сул гллта исз ш с плотнС СТь г ,5 г/мл п :;ентр cy K ib c тр . Ркп ля яиетил К ; :у;| тс1 ь; (i:..- 7i r ;к-к:;а:; Si-J 0,1). Нал ки нас- лг пттяют 0,3 :-1л nj C iM-i и иеитриоугл-фую ; :;ень;:1е; 1 -5ере м течение Л ч (предпочтительно 12-19 ч) при и 30 000 ц. После г-елтрифугирот аиия ipy6KJi прокалмв лот на дне и фракцтго- нируют ;bpaK U3i ио 9 кале;1ь (0,4 ш) на фрп;;иии. Oj i-ui каж,до/ фракции исис пьзу от для определения ради: акт;т:;ости, осталь %;лс 0,3 г-;л разбав.т7люг одинлгсс вь ;-; воды л хранят лри -20 С После того, как .лр;-; : Я кп сг Лра -:тпп-1 Ил РОтся ;- -Гчс:тм;1,Л7 lie- - i;ii;n ; ;i -:T iP;;ocTb вь оира

., Опл со; ,ер;:;ат и-РНК.

-. ;;с:- ccv.r. 1лтет о;соло 1 -2;ч1П , :; airi sii CKOB 1слол.зу1от вм- F vc AI;I:;;CCрт л , Г ИГ ус илль вч-кового лт 5 :-;ubji(i..i.. нир ус я .,, вирус встоялой осп -ь илтус Kopir, il iS-антигон 5 соьгятичс скил а чтиген Е, коу;и, зригрс ци ы овлы ЛЛГ столбняч- TiL-й ;оксил и слете:ibi с ои л олевыми кле ;ками, няпри ср LC :.u pCKirx сви- iicKj р815 .;ьп;т1: лВЛу, L 1210 рчыши 7(НЛ 1 , я тД Лк иилуцированлая лолио- )усом с:1 . : оль Ль оигл „ Первые

с аттекуирсг алн-чМ вирусоь кори Мо- ратсл и ИБУ--гв чл-сног,:, Соо ветстзу- ислыталн/ т оказа ги, гто лерс- : 1-рстльк ркаклил ле лроисхсд1тло, Тем образуются и-л ИК 11ысокоспеди- фи1-1еского л -йств я в зав ;С11Мостп от :oc i встствелнс лспользованлого алти- г 3 л а i