12501
2. Способ ПОП.1, отличаюийся тем, что плазмиду рКС222 олучают обработкой плазмиды рКС7 - ерментами рестрикции Sal I и Bgl I с последующим сшиванием полученных рагментов с фрагментами 2,75 кв Sal I/Bgl II.
3- Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что плазмиду pSC701 получают сшиванием фрагментов 7,5 кв Bgl II. .
4.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиду рКС257 получают обработкой плазмиды pSC701 ферментом рестрикции Нае II, а затем полученные фрагменты сшивают.
5.Способ по п.1j отличающий с я тем, что плазмиду рКС261 получают обработкой плазмиды рКС257 ферментом рестрикции Sac 1, а затем полученные фрагменты сщивают.
6.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиду рКС275 получают обработкой ферментом Нае II плазмиды рКС261 и pUR222, а затем полученные фрагменты сшивают.
7.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиду рКС264 получают обработкой ферментом рест- рикции EcoR I плазмид рКС259 и уЕР24, затем полученные фрагменты сшивают.
8.Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что плазмиды рКС214 и рКС215 получают обработкой плазМИДЫ pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II с последующим сшиванием полученных фрагментов с 7,5 кв Bgl II фрагментами плазмиды рКС203.
9.Способ по n.l, о т ли ч аю - щ и и с я тем, что плазмиды pGD I
и pGD 2 получают обработкой плазмиды pLG669 ферментом рестрикции Ват HI с ПОСЛ.&ДУЮЩИМ сшиванием полученных фрагментов с 7,5 кв Bgl II фрагментами плазмиды рКС203.
10.Способ поп.ТэОтлича- ю щ и и с я тем, что плазмиды рСБЗ и pGD4 получают обработкой плазмиды РФ4 ферментом рестрикции Hind III и добавлением Hind III , связки к 7,5 кв Hind III фрагменту плазмиды рКС203 с последующим сшиванием фрагментов.
11.Способ по n.i, о тл ич аю - щ и и с я тем, что фрагмент 1,62 кв EcoR I/Sal I получают обработкой плазмиды рКС222 ферментами рестрикции EcoR I и Sal I.
74
12.Способ по П.1, отличающ и и с я тем, что фрагмент 1,51 кв Sal I/Bgl II получают обработкой плазмиды рКС222 ферментами рестрикции Sac I и Bgl II.
13.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиды pGDIO
и pGDI1 получают обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II 1и добавлением к 1,51 кв EcoR I/Sal I фрагменту плазмиды рКС203 Bgl II связки, а затем полученные фрагменты сшивают.
14.Способ по П.1, отличаю- щ и и с я тем, что плазмиды pGD 12 и pGD 13 получают обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции
Bgl II и добавлением к 1,65 кв EcoR I/Sal I фрагменту плазмиды рКС203 Bgl II связки, а затем полученные фрагменты сщивают.
15.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиды pGD14
и pGDl5 получают обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II и добавлениемк 2,75кв Sal/Bofi В фрагме ту плазмидырКС203Ва.йНевязки,а затем полученные фрагментысщивают.
16.Способ по П.1, отличающийся тем, что плазмиды pL0314 и pL0315 получают обработкой плазмид рКС259 и pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II, а затем полученные фрагменты сшивают.
.17. Способ по П.1,отличающ и и с я тем, что плазмиды pL0316 и pL0317 получают обработкой плазми- ды.рКС257 ферментом рестрикции Sal I : добавлением Bgl связки к S ac I окончанию линейной последовательности ДНК и обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом, рестрикции..Bgl II, а затем полученные фрагменты сщивают.
18.Способ по П.1, отличаю- ;щ и и с я тем, что плазмиды рЪ0320 и pL0321 получают обработкой плазмиды рКС275 ферментом рестрикции Sac 1 добавлением Bgl II связки к Sac I окончанию линейной последовательности ДНК и обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II, затем полученные фрагменты сшивают.
19.Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что плазмиду pL0378 ползд1ают обработкой плазмиды рБК322 ферментом рестрикции pSt1 и плазмиды рКС264 ферментом рестрикции pStI, затем полученные фрагменты сшивают.
I
Изобретение относится к генной инженерии, а именно к получению гибри ных плазмид, содержащих последовательность ДНК, передающую устойчивость к гигромицину,
На фиг. 1-10 представлены карты плазмид рКС203, pSVSgpt, рКС214, рКС215, рКС222, pSC701, рКС257, рКС259, рКС261, PRC275, рКС259,. рКС261, рКС275, рКС264, pL0378 и рКС273 соответственно.
В описании использована следующая терминология.
Структурный ген - последовательность ДНК, которая кодирует полипептид.
Контрольный элемент - последовательность ДНК, которая частично про мотирует и регулирует экспрессию структурального гена.
Эукариотньй промотор - последовательность ДНК, которая частично прокотирует и регулирует экспрессию структурального гена в эукариотной клетке.
Прокариотный репликон - последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует репликацию ДНК в прока- риотной клетке.
Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК - любой агент, включая, плазмиды бактериофаги и -вирусы, состоящий из молекулы ДНК, к которой могут быть добавлены один или более дополнительных сегментов ДНК.
Трансформация - введение ДНК в реципиент - клетку хозяина, которое изменяет генотип и, следовательно, приводит к стабильному и наследуемому изменению в клетке-реципиенте.
Вставной изомер - одна из двух или более возможных рекомбинантных молекул ДНК, образовавшихся при вставке фрагмента ДНК, в один из двух или более совместных центров на реципи- i енте ДНК..
Пример 1. Плазмида рКС203 (фиг.1).
А. Вьщеление плазмиды ДНК из E.coli JR225.
Культивируют бактерии E.coli JR225 (АТСС № 31912) в ТД-бульоне (1% трип- тона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,57:, хлористого натрия, рН 7,4) со 100JUг/кл антибиотика гигромицина В традиционным микробиологическим методом. После 18 ч инкубации примерно 0,5 мл культуры переносят в трубку
501742
Эппендорфа емкостью 1,5 мл и центрифугируют около 15 с. Если нет других указаний, все манипуляции осуществля- .ются при комнатной температуре, Обра- 5 зевавшийся верхний слой осторожно удаляют тонким наконечником аспиратора, и клеточный осадок суспендируют примерно в 100 л свежеприготовленного лиэоцимного раствора, кото 0 рый содержит 2 мг/мл лизоцима, 50 мм гл ркозы, 10 мм ЦЦТА (пиклогександи- аминотетраацетата) и 25 мм трис-НСЕ . (рН 8,0). После инкубации при О С в течение 30 мин прибавляют примерно
5 200 jun щелочного раствора НДС (нат- рийдодецилсульфата) (0,2 н. NaOH, 1% НДС) и трубку осторожно встряхивают, а затем выдерживают 15 мин при О С. Прибавляют примерно 150((Л
20 3-молярного ацетата натрия (приготовленного растворением 3 моль аце тата натрия в минимальном количестве воды, установлением.рН 4,8 с помощью ледяной уксусной кислоты, а затем до25 ведением объема до 1 .л) и затем содержимое трубки осторожно пере меши- вают перевертыванием в течение нескольких секунд, во время которых образуется сгусток ДНК.
30 Трубку вьщержйвают при в течение 60 мин, а затем центрифугируют 5 мин, получая почти прозрачный верхний слой. Переносят примерно
0,4 мл верхнего слоя во вторую цент 35 риФужную трубку, куда добавляют 1 мл холодного этанола. После вьздерживания.. трубки при -20 С в течение 30 мин полученный осадок собирают цейтри- фугированием (2 мин) и удалением 0 верхнего слоя аспиратором. Растворяют собранный таким образом осадок в 100 0,1 молярном ацетате натрия (0,05 М трис-НСб, рН 8) и повторно осаждают добавлением 2 объемов хо- 5 лодного этанола. После 10 мин при 20 С осадок собирают центрифугированием, как описано вьш1е. Он представляет собой требуемую плазмиду ДНК E.coli JR225.. .
0 .Б.Трансформация E.coli JR225 плазмиды ДНК и выделение плазмиды рКС203.
Растворяют осадок E.coli JR225 плазмиды ДНК в примерно ioOJl4л 0,1- молярного ацетата натрия (0,05 М
5 грис-НСЙ, рН .8) и осаждают 2 объема- /4И холодного этанола. Собирают полученную плазмиду ДНК и затем растворяют примерно в 40 мл воды или разбавляют буфером и, наконец, используют для трансформации E.coli К12 БЕ827 в соответствии с методикой трансформации (Wensink, 1974, Cell 3:315). E.coli K12 BE827 хранится в Американской коллекции типов культурРокквилл, Мэрилэнд, номер АТСС 31911. Полученные трансформанты отбирают на ТД- агаре (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, 1,5% агара, рН 7,4), содержащем 200jUг/мл антибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как показано гель-электрофорезом и другими тестами, содержат как большие, так и меньшие (15 кв) плазмиды и являются устойчивыми как к антибиотику ампициллину, так и к гигромицину
В. Другие трансформанты содержат только меньшую, чем 15 кв плазмиду и являются устойчивыми к антибиотикам гигромицину В и С418, но являются чувствительными к ампициллину.
Трансформанты последнего типа помещают на ТД-агар, содержащий 1 мг/мл 25 методикой антибиотика гигромицина В, и культивируют с использованием стандартных микробиологических методик. Используют полученные клетки в соответствии с процедурой примера 1А для вьщеления описанной устойчивой к гигромицину В и С418 15 кв плазмиды плазмиды рКС203. Наличие генов устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С41В в плазмиде рКС203 подтверждается последующей трансформацией и селекционным анализом.
Пример 2. Вьщеление генов устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С418 и контрольных элементов.
12501744
антибиотикам гигромицину В и С41В и контрольные элементы. Это подтверждается трансформацией и селекционным анализом, который показьгеает,
5 что клетки, которые обычно являются чувствительными к антибиотикам гигромицину В и С418, являются устойчивыми при трансформации 7,5 кв Bgl II фрагмента.
to Пример 3, Конструирование плазмид рКС214 (фиг.2) и рКС215 (фиг.4) и трансфо Е)мантов E.coli К12 ВЕ827/рКС214 и E.coli К12 ВЕ827/рКС215. Плазмида pSV5gpt , (фиг.2), конструк15 ция которой описана Муллиганом и Бергом, 1980, Schience 209/44637:1422, имеет только один участок Bgl II в gpt-гене. Клонирование позволяет осуществить экспрессию генов устойчивос20 ти кантибиотикам гигромицинуВ иС418, i
та при нагревании в 70 С
30
Обрабатывают около 5 -jUr плазмиды pSV5gpt ДНК Bgl II рестрикционным ферментом в соответствии с известней После инактивации ферментечение 5 мин
при /и С смешивают примерно 1 ) г ДНК в соотношении 1:1 с 7,5 кв Bgl II фрагментом рКС203. Фрагменты соединяют, используя ДНК-лигазу фага Т4. ДНК-лигаза и инструкции могут быть получены из следующих источников: Бетесда Рисерч Лабораториз, Бокс 6010, Рокквилл, Мэрилэнд 20850.
Лигатированнуто смесь используют
35 для трансформации E.coli К12 БЕ827 в соответствии с известной методикой (Wensink 1974, Cell 3:315) на ТД- пластинах, содержащих 100 juг/мл каждого из антибиотиков ампициллина и апрамицина. Рекомбинантные клоны помещают на ТД-пластины, содержащие 100,/иг/мл ампициллина--и 200 //г/мл антибиотика гигромицина Б. Около по- ловины рекомбинантных клонов, устой-:
40
Обрабатывают примерно г плазмиды рКС203 ДНК.;Ф§1 II рестрикционным ферментом в соответствии с известной методикой. Рестрикционные ферменты и инструкции, могут быть получены из следующих источников: Бетесда Рисерч Лабораториз Инк., Бокс 6010, Рокквилл Мэрилэнд 20850, Боерингер Маннхейм Биохемикалс 7941 Кастлевей Драйв И.О. Бокс 50816 Индианаполис. Индиана 46250,-Нью Инглэнд Био Лабе., Инк. 283 Кэбот. Беверли, Массачусеттс 01915, Рисерч Продактс Миле Лаборато- риз Инк., Элкхарт, Индиана 46515. Из 7,5, 5,8 и 0,5 кв фрагментов собирают 7,5 кв Bgl II фрагмент, содержа- mjift требуемые гены устойчивости к
методикой
та при нагревании в 70 С
Обрабатывают около 5 -jUr плазмиды pSV5gpt ДНК Bgl II рестрикционным ферментом в соответствии с известней После инактивации ферментечение 5 мин
при /и С смешивают примерно 1 ) г ДНК в соотношении 1:1 с 7,5 кв Bgl II фрагментом рКС203. Фрагменты соединяют, используя ДНК-лигазу фага Т4. ДНК-лигаза и инструкции могут быть получены из следующих источников: Бетесда Рисерч Лабораториз, Бокс 6010, Рокквилл, Мэрилэнд 20850.
Лигатированнуто смесь используют
для трансформации E.coli К12 БЕ827 в соответствии с известной методикой (Wensink 1974, Cell 3:315) на ТД- пластинах, содержащих 100 juг/мл каждого из антибиотиков ампициллина и апрамицина. Рекомбинантные клоны помещают на ТД-пластины, содержащие 100,/иг/мл ампициллина--и 200 //г/мл антибиотика гигромицина Б. Около по- ловины рекомбинантных клонов, устой-:
чивых к антибиотику .гигромицину. В, содержат плазмиду рКС214 (фиг.З), тогда как остальные содержат пла зми- ду РКС215.
Выделяют плазмиду ДНК из приведенных клонов в соответствии с методикой примера 1А и идентифицируют рестрикционным ферментным анализом. Так же индентифицируют сконструированные плазмиды рКС214 и рКС215 и
сконструированные трансформанты
E.coli К12 ВЕ827/РКС214 и E.coli К12 ВЕ827/рКС215 и затем вьщеляют для дальнейшего использования.
Пример 4. Конструирование клеток Мьпиь Ltk /pKCZlA.
К-упьтивируют клетки Мышь Ltk регулярным сохранением клеток в сред9 содержащей минимум основной среды с солями Ирла (Earle) и неосновных f аминокислот (Eagle 1959, Science 130:432), 10% объем/объем сыворотки новорожденного теленка и 292 г/мл глютамина. Культивированные таким 9 бразом клетки Мьпиь Ltk затем трансформируют плазмидой рКС214 известным спо.собом по методике Виглера с сотр. 197 9, Ргос.Nat.Acad.Sc i.USA 76/3/:1373, с тем исключением, что прибавляют 100-300 иг плазмиды ДНК на каждую пластину з 1 мл осажденного фосфата кальция Культивируют среду, описанным образом. После 4 ч .инкубации при , среду переносят свежую среду и культивируют клетки еще 20 ч. В это время осуществляют давление отбора антибиотиком - гиг- ромицином В, заменяя среду селективной, дополнительно содержащей 75- lOOOjUr/HTf антибиотика гигромицина В. Предпочтительная концентрация антибиотика для селекционной среды 200 Мг/мл. Селективную среду; й аменя ют после первого дня, затем через два дня и, наконец, на каждый третий день в течение 2-3 недель, во время которых вырастают трансформан ные клоны. Колонии собирают вручную используя пипетку, и вьфащивают в массовой культуре при непрерывном давлении отбора. Культивированные таким образом устойчивые к гигроми- цину В клетки включают требуемые трансформанты Кьппь Ltk pKC214.
Пример 5. Конструирование клеток Мьшь Ltk рКС215. , Конструирзпот клетки Ltk рКС215 в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что для трансформации используют не плазмидУ рКС214, а плазмиду рКС215. Сконструированные таким образом трансформанты Мышь Ltk рКС216 затем выращивают в массовой культуре.
Пример 6. Устойчивость трансформантов к антибиотикам гигроми- цину в и C 4l8.
Способность плазмид рКС203, рКС214 и рКС215 придавать устой й вость к ан тибиотикам гигромицину В и С418 опре деляют путем испытания трансформиро20
25
ванных и не трансформированных клеток E.coli и Мьшгь Ltk на рост в
. среде с различным количеством анти5 биотиков-. Среда, и условия культивирования для клеток E.coli и Мьшь Ltk
. то же, что и в примерах 1А и 4. Результаты испытаний устойчивости к гигромицину В даны в табл.1, к гигро10 мицину С418 - в табл.2.
Клетки Кьшгь Ltk рКС214 и Мьш1ь Ltk рКС215 не только воспроизводятся при концентрации 400 /«г/мл, но выживают , и при..,более высоких концентрациях, 5 превышающих 1000 Wг/мл.
Прим е р 7. Конструирование . плазмид рСД1 и рСД2 и трансформантов E.coli К12ВЕ827/РСД1 и E.coli К12 ВЕ827/РСД2.
Плазмида pLC669 конструкция которой описана Guarente and Ptasline 1981, Ргос, Nat. Acad. Sci, USA 78/4/:2199, содержит единственный рестрикционный BamHl участок в ци- тохромном гене. Клонирование 7,5 кв ВрД II фрагмента плазмиды рКС203 в этот участок позволяет произвести экспрессию гена устойчивости к антибиотику гигромицину В. Требуемую вставку легко осуществить, так как Вр1 II фрагменты содержат 5 протя- женностей с последовательностью ГАТК, которые.являются идентичными 5-ти протяженностям ВатН I фрагментов. 5 Следовательно, Bgl II фрагменты и
Вага И фрагменты являются совмести- . мыми и могут быть легко связаны для : получения рекомбинантов. j Плазмиды рСД1 и рСД2 и трансфор- 0 манты E.coli К12 ВЕ827/рСД1 и E.coli К12 ВЕ827/рСД2 конструируют в соответствии с методикой примера 3 с, но с использованием плазмиды pLC699 с одним участком ВатпН I вместо плаз- МИДЫ pSV5gpt. В зависимости от ориентации Bgl II фрагмента получают плазмиды с двумя ориентациями. Плазмида рСД1 означает рекомбинантные плазмиды, в которых Sali рестрикцион- :ный участок-ближе к ura-гену. Плазмида рСД2 означает плазмиды с обратной ориентацией.
Пример 8. Конструирование клеток Saccharomyces cerevisiae/pCД.I 5 Выращивают дрожжи Saccharomyces cerevisiae на 1% дрожжевом экстракте (2%-бактопептона) с использованием традиционных микробиологических про0
цедур. Трансформацию плазмиды. рСД1 в дрожжи осуществляют в соответствии с известной методикой Hinnen at all. 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929. Отбирают трансформанты при добавлении летальных доз антибиотика гигромицина В к культуральной среде.
Пример 9. Конструирование клеток Saccbaromyces cereviaiae/pCfl2
Трансформанты конструируют в соответствии с методикой примера 8с тем исключением, что используют плазмиду рСД2 вместо плазмиды рСД1.
Пример 10. Конструирование плазмид рСДЗ и рСДА и трансформантов E.coli К12 ВЕ827/РСДЗ и E.coli К12 ВЕ827/РСД4.
Плазмида р04, конструкция которой описана Solnick 1981, Cell 24:135, содержит большую часть -Аденовируса 2 (А 2) позднего промотора на карте, скоординированной 15,4 (EcoR I) до- 16,6 (Hind III). Клонирование 7,5 кв Вя1 II фрагмента плазмиды рКС203 в Hind III участок плазмиды р04 позволяет произвести экспрессию гена ус- тойчивости к антибиотику гигромици- ну В.
Требуемую конструкцию получают при добавлении в соответствии с известной методикой Ульриха с сотр. (1977 Science 196:1313) Hind III связок к 7,5 KB Bgl II фрагменту и последующего связывания модифицированного таким образом фрагмента с Hind III обработанной плазмидой р04 при использовании Т4 ДНК-лигазы. (Hind III /d/ККААГКТТГГ/ и другие связки доступны из Кодлаборатив Рисерч Инк., 1365 Мэйн Стрит, Вальтам, МА 02154). После обеспечения 7,5 кв Bgl II фрагмента Hind ill связками проводят свя зьгоание фрагмента в плазмиду р04 для образования плазмид рСДЗ и рСД4 в соответствии с методикой примера 3. Последующую трансформацию в E.coli К12 ВЕ827 для образования E.coli К12 ВЕ827/рСДЗ и E.coli К12 ВЕ827/рСД4 также проводят в соответствии с методикой примера 3. .
Как и в примерах 3 и 7, плазмиды двух ориентации получают в зависимости от ориентации вставленного придающего устойчивость фрагмента. Плазмн да рСДЗ означает рекомбинантные плазмиды, в которых Sal 1 рестрик
ционный участок в ставленного придающего устойчивость к антибиотику гиг- ромицину В фрагмента ближе с EcoR I центру Ad2 промотора. Плазмида рСД4 означает плазмиды с обратной ориентацией.
Пример 11. Конструирование клеток Мышь Ltk /рСДЗ.
Проводят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду рСДЗ вместо плазмиды рКС214.
П.р и м е р 12. Конструирование клеток №ш1Ь Ltk /pCД4.
Проводят по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду рСД 4 вместо плазмиды рКС215.
Пример13. Конструирование Плазмида р:КС222 и трансформанта E.coli К12 ВЕ827/РКС222.
А. Вьщеление 2,75 кв Sal I/Bgl II фрагмента плазмиды рКС203.
Обрабатьтают.известным способом по методике, упомянутой в примере 3,. /iipiSiepHO 5 yt/r плазмиды рКС203 ДНК Sal Г и Bgl II рестрикционными ферментами. Выделяют традиционным способом 2,75 кв. фрагмент, которьй содержит гены и контрольные последовательности устойчивости к антибиотикам гигромици- ,ну В и G418.
Б. Связывание и окончательное конструирование.
.
Обрабатывают Примерно плазмиды рКС7, конструкция которой описана Рао и Роджером, 1979, Cell, 7:79, Sal I и Bgl II рестрикционньп ш ферментами. После инактивации ферментов при нагревании при 70 С в течение 5 мин примерно 1 jur ДНК смешивают в соотношении 1:1 с 2,75 кв Sal I/Bgl II фрагментом рКС203. Соединяют фрагменты, используя Т4 ДНК-лигазу, в соответствии с методикой примера 3. Полученную плазмиду рКС222 трансформируют в E.coli К12 также по методике пример 3. Получают приданную устойчивость к антибиотикам ампициллину, гизгромицину В и С418.
Пример 14. Вьщеление 1,51 кв Sa.c I/Bgl II фрагмента плазмиды рКС222 (фиг. 5), придающего устой- чивость к гигромицину В..
Вьщеляют требуемый фрагмент ДНК . в соответствии с )1етодикой примера .13А, с тем исключением, что для ре
стрикционного переваривания Bgl II используют Sac I, а не Sal I.
П р и м е р 1-5. Выделение 1,65 кв EcoR. I/Sal I фрагмента плазмидь рКС222, придающего устойчивость к гигромицину С418.
Вьщеляют требуемый фрагмент ДНК в соответствии с методикой примера 13А С тем исключением, что для рестрикци онното переваривания использу1ют EcoR I, а не Bgl II, с Sal I.
Пример 16. Конструирование плазмид рСДЮ и рСД11 и трансформан- :ТОв E.coii К12 ВЕ827/рСД10 и E.coli К12 ВЕ827/РСД11,
..Конструируют требуемые плазмиды по методике примеров 3 и 10, с тем исключением, что используют 1,51 кв Sac I/Bgl II фрагмент плазмиды рКС222 вместо 7,5 кв Bgl II фрагмента плазмиды рКС203 и к придающему УСТОЙЧИВОСТЬ к антибиотикам фрагмент присоединяют Bgl II, а не Hind III связки. 1,51 KB фрагмент в Bgl II связками- вставляют в плазмиду pSV5gp по методике примера 3.
Как ив примерах 3 и 7, получают плаэмиды двух ориентации в зависимости от ориентации вставленного i фрагмента, придающего устойчивость к антибиотику. -Плазмида рСДЮ означает рекомбинантные плазмиды, в которых Ava I рестрикционный участок вставленного придакицего устойчивость к гигромицину В фрагмента ближе к Hind III участку gpt-гена. Плазмида рСД11 означает плазмиды с обратной ориентацией.
Трансформацию плазмид рСДЮ и рСД11 в E.coli К12.ВЕ827 с образованием соответственно E.coli К12 ВЕ827/РСД10 и E.coli К12ВЕ827/РСД11 осуществл5пот по методике примера 3. Пример 17. Конструирование клеток Мышь .
Конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 4,с тем исключением, что используют плазмиду рСДЮ, а не плазмиду рКС214 при трансформации. Сконструированная таким образом Мышь Ltk /pCД10 может быть вьфащена в массовой культуре. Пример 18. Конструирование клеток Мьщь Ltk /рСД11.
Проводят конструирование в соответ ствии с методикой примера 4 с тем исключением, что в процедуре тран
10
сформации используют плазмиду рСД11, а не плазмиду рКС214. Сконструированная таким образом Мышь Бси /рСД11 может быть выращена в массовой культуре .
Пример 19. Конструирование плавмид рСД12 и рСД13 и трансфор- мант.ов E.coli К12 ВЕ827/рСД12 и E.coli К12 ВЕ827/РСД13.
Плазмиды конструируют в соответствии с методикой примеров 3 и 10, с тем исключением, что 1,65 кв EcoR I/Sal I фрагмент плазмиды 15 рКС222 используют вместо 7,5 кв Bgl II .фрагмента плазмиды рКс203 и Bgl II, а не Hind III связки присоединяют к придающему устойчивость к антибиотику фрагменту. 1,65 кв 20 фрагмент с Bgl II связками вставляют в. плазмиду pSV5gpt в соответствии с методикой примера 3.
Как и в примере 16 получают плазмиды двух ориентации. Плазмида 25 рСД12 означает рекомбинаитные
плазмиды, в которых Pst I рестрикционный .участок уставленного придающего устойчивость к антибиотику С418 фрагмента ближе к Hind III 0 участку gpt-гена. Плазмида рСД13 означает плазмиды с обратной ориентацией. .
Трансформация плазмид рСД12 и рСД13 в. E.coli К12 ВЕ827 соответственно с 5 образованием E.coli К12 ВЕ827/рСД12 и E.coli JK12 ВЕ827/рСД13 также проводится в соответствии с методикой примера 3, с тем исключением, что для селекции трансформантов использу- 0 ют антибиотик с418, а не гигромицин ,В..
Пример 20. Конструирование клеток Мышь Ltk /pCД12.
Конструирование осуществляют в со- .ответствии с методикой примера 4, с . тем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД12, а не плазмиду рКС214 и для селекции трансформантов используют антибиотик С418, а не гигромицин В. Сконструированные таким образом Мышь Ltk /pCД12 могут быть выращены в массовой культуре.
Пример 21. Конструирование клеток Мьш1Ь Ltk /pCД13.
Конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформа5
0
5
111
ции используют плазмиду рСД13, а не плазмиду рКС214, и для селекции трансформантов используют антибиотик СА18, а не гигромицин В. Сконструированные таким образом Мышь Ltk /pCfllS могут быть выращены в массовой культуре.
.Пример 22. Конструирование плазмид рСД14 и рСД15 и трансформантов E.coli К12 ВЕ827/РСД14 и E.coli ВЕ827/рСД15.
. Выделяют 2,75 кв Sal I/Bgl II фрагмент плазм иды рКС203 по методике примера 13. Затем присоединяют молекулярные связки в соответствии с методикой примера 10, с тем исключением, что используют Bgl II, а не Hind III связки. Полученный фрагмент затем вставляют в плазмиду pSV5gpt по методике примера 3 для образования желаемой плазмиды..
Как и в примере 16, получают плазмиды двух ориентации. Плазмида рСД14 означает рекомбинантные плазмиды, в которых Ava I рестрикционный участок .придающего устойчивость к антибиотику фрагмента ближе к Hind III участку gpt-гена. Плазмида рСД15 означает плазмиды с обратной ориентацией.
Тран сформацию плазмид рСД14 и рСД1 в E.coli К12 ВЕ827 для образования соответственно E.coli К12 ВЕ827/рСД1 и E.coli К12 ВЕ827/рСД15 также проводят по методике примера 3.
Пример 23. Конструирование клеток Мьшь Ltk /p 14.
Конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД14, а не плазмиду рК:С214. Сконструированный Мьшь Ltk /рСД14 может быть выращен в массовой культуре. .
.Пример 24. Констрзшрование клеток Мьппь LtlfT/рСЛ 5.
Осуществляют конструирование в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД15, а не плазмиду рКС214. Сконструированный таким образом Мьппь Ltk /pCД14 может быть выращен в массовой культуре.
Пример 25. Конструирование плазмиды pSC701 и трансформант E.col К12 BE827/PSC701.
Инкубируют при 37 с в течение 1 ч примерно 5 плазмиды рКС203
10
15
20
25
01
с
5
30
35
0
5
0
7412
(вьоделенной в примере 1) в ТВ-буфере (10 мл трис-НСЙ, рН 8,0, 1 мм ЭДТУК) 5/Ил ДТТ (100-мм дитиотрейтола), . 5 ил () БСА (бычьего сы- , вороточного альбумина), 25уил воды, 10Х реакционной смеси (600 мМ NaCl, 100 мМ трис-НСВ, рН 7,4, 100 мМ MgCl) 5//л (5 единиц) Bgl II рестрикционного фермента. Реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин, затем реакционную смесь выливают на лед, экстрагируют фенолом и смесью хлороформа с изоами- ловым спиртом (24:1), затем осаждают этанолом. Растворяют полученные Bgl II рестрикционные фрагменты в 5 //л 5 мМ хлористого натрия и затем связьтают. Связывание,проводят при взаимодействии 1 Jмл Bgl II рестрикти- рованной ДНК с примерно воды, 5уил (10 мМ) АТФ, 5 J4л связывающей смеси (500 мМ трис-HCt, рН 7,8, 200 мМ дитиотрейтола, 100 мМ MgCl ) и Т4 ДНК-лигазы ( Нью Ин- глэнд Биолаб единиц) при в течение 16ч.
Реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин. После охлаждения на льду используют полученную связанную смесь для трансформа- ; ции E.coli К12 ВЕ827 по известной ме тодике транфррмации Wensink 1974j
на ТД-пл ас тинах, содержащих 200 антибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как показывает гель-электрофорез, содержат только требуемую, 7,3 кв плазмиду. Такой трансформант E.coli К12 BE829/pSC701 - отбирают на пластинах с ТД-агаром, содержащих 200 н r/ji/л антибиотика гигромицина В ,, а затем культивируют, используя традиционные микробиологические методики. Полученные клетки используют для вьщеле- ния плазмиды pSC701 в соответствии с методикой примера ТА. Наличие генов устойчивости к антибиотику гигроми-- цину В и С418 в штазмиде pSC701, кроме того, подтверждается последующей трансформацией, отбором и рест- риктивным ферментным анализом. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды ,pSC701 дана на фиг.6..
Пример 26. Конструирование плазмид рКС257 и рКС259 и трансформанты E.coli К12ВЕ783/РКС257 и E.coli К12 ВЕ783/РКС259.
25
Плазмиду готовят в соответствии с методикой примера 25, с тем исключе-, нием, что используют плазмиду pSC701 и Нае II рестрикционный фермент и 10Х реакционную смесь (60 мМ трис-- НС1,.рН 7,4, 60 мМ MgClj), а не п лазмиду рКС203 и Bgl II рестрикционный фермент и реакционную смесь. Плазмида pSC701 содержит более одного Нае II рестрикционного участка, следовательно Нае II переваривание If последующее связьгоание приводят к смеси различных плазмид.
Полученную связанную смесь, которая содержит требуемую придающую
устойчивость к ГИГрОМИЦИНУ В, 4,2 КБ
плазмиду рКС257, а также придающую устойчивость к апрамицину, гигроми- дину В и С418,,0 кв, плазмиду рКС259, используют для трансформации в E.coli К12 ВЕ873 (хранится в коллекции культур Северной регио- .нальной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс, под номером В-15020) по методике трансформации примера 25.
Отбирают требуемые трансформанты, помещают на пластину с ТД-агаром, содержащим 200 /иг/мл антибиотика гигромицина В, а затем культивируют каждый отдельно, традиционными микробиологическими методами. Трансформанты, содержащие рКС257, легко и удобно идентифицируют с помощью скрининга на устойчивость к гигроми- цину В, а трансформанты, содержащие плазмиду рКС259, идентифицируют с помощью скрининга на устойчивость к апрамицину и гигромицину В. Трансформанты E.coli К12 ВЕ783/РКС257 и E.coli К 12 ВЕ783/рКС259 используют для выделения плазмид р.КС257 и рКС259 соответственно по методике примера 1А. Наличие генов устойчивости к а.н-. тибиотикам в соответствующих плазми- дах подтверждается последующей тран- сформацией отбором и рестрикционным ферментным анализом. Рестрикционный
участок и функциональная карта каждой из плазмид рКС257 и рКС259 показаны 50 на фиг. 6 и 7 соответственно.
Пример 27. Конструирование лазмиды рКС261 и трансформант E.coli 12 ВЕ783/РКС261.
Плазмиду готовят по методике при- 55 ера 25, с тем исключением, что исользуют плазмиду рКС257 Sau ЗА1 ретрикционный фермент и реакционную
35
40
30
45
20
5
5
смесь 10Х (500 мМ NaCl, 60 мМ HCt, рН 7,5, 50 мМ МрС), вместо плазмиды pSC701, Bgl II рестрикционного фермента и реакционной смеси. 5 Плазмида рКС261 имеет ,2 кв и придает устойчивость к гигромицину В. Используют полученнзто связанную реакционную смесь для трансформаций E.coli К12 ВЕ783 в соответствии с
10 процедурой трансформации примера 25. Трансформанты - E.coli К12 ВЕ783/рКС261 - отбирают и исполь-- зуют для выделения плазмиды рКС261 в соответствии с примером 1А. Нали15 чие гена устойчивости к антибиотику гигромицину В в плазмиде рКС261 подтверждается последующей трансформацией, отбором и анализом последовательности ДНК. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС261 показаны на фиг.7.
Пример 28. Конструирование плазмиды рКС275 (фиг. 8) и трансформант E.coli К12 ВЕ1041/РКС275.
A.Частичная Нае II рестрикция плазмиды рКС2б1.
Инкубируют при 37 С в течение 1 ч примерно 5 ,/1/л (5 г) плазмиды рКС261, выделенной в примере 27, в ТЕ-буфере 5/гл ДТТ, 5/ л (1000 мг/мл) БСА, 25 л воды, 5 у«л (5 единиц) .Нае II рестрикционного фермента и 5Jin 10Х реакционной смеси. После завершения
А
реакции инкубирования при 70 С в течение 5 мин реакционную смесь охлаждают на льду, экстрагируют фенолом и смесью хлороформ - изоамиловый спирт (24:1), а затем осаждают этанолом. Полученные Нае II рестрикцион1Ш1е фрагменты растворяют в 5 yw л 5 мМ NaCl.
B.Вьщеление y394nt р1 ас фрагмента, содержащего Haie II окончание.
0
Примерно 5 «л (5уг) плазмиды PUR222, вьщеленной на E.coli К12 ВЕ1166/pUR222, в соответствии с ме- ;тодикой примера 1 в ТЕ-буфере Нае II переваривают в соответствии с мето- (икой примера 28А, с тем исключением, что реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, чтобы обеспечить полное, а не частичное переваривание. Полученные в результате Нае II рестрикционные фрагменты растворяют в 5 л и 5 мМ NaCl.
E.coli К12 BE1166/pVR222 является щтаммом, хранящимся в коллекции культур Северной региональной иссле 151
довательской лаборатории, Пеория, Иллинойс, под номером В-15023.
В. Связьтание и трансформация.
Проводят реакцию при Ь°С в течение 16 ч примерно каждой из i плазмид рКС2,61 и плазмиды pUR222 Нае II рестрикционных фрагментов ((роответственно приготовленных по примерам 28А и В), 31 л воды, 5jnn (10 мМ) АТФ, 5Jмл связывающей смеси и 1 lUn Т4 ДНК-лигазы ( единиц). После завершения реакции инкубированием при в течение 5 мин полученную связанную смесь охлаждают на льду. Затем ДНК трансформируют в E.coli К12 ВЕ1041, хранящуюся в к ол- лекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории Пеория, Иллинойс, под номером t В-15021, в соответствии с методикой трансформации примера 251 Трансформанты, содержащие только требуемую, 3,6 KB, плазмиду рКС275, обозначе- как E.coli К12 ВЕ1041/рКС275.. Такой трансформант отбирают, вьфащиваю на пластине, культивируют и используют для последующих вьщелений плазмиды. Ка наличие 394ntplac-coдepжaщeгo фрагмента, так и детальную структуру плазмиды рКС275 удобно определять с помощью гель-электрофорезногр и ре- стрикционного ферментного анализов.
Поскольку плазмида рКС261 имеет три Нае II рестрикционных участка, частичное Нае II переваривание при- водит к смеси различных Нае II фрагментов, а далее к конструкции как плазмида рКС275, так и различных обратных изомеров плазмиды рКС275. Рекомбинантные пла змиды обеих ориентации получают так же в связи с тем, что 394iitplac-co- держащий фрагмент может быть связан; в любом направлении. Различно ориентированные изомеры плазмид, а также полученные р результате трансформанты могут бБгть легко выделены и идентифицированы традиционными средствами. Рестрикционный участок и функцискальная карта плазмиды рКС275 пред- ставлены на фиг. 8.
Пример 29. Конструирование плазмиды рКС264 (фиг. 8) и трансформант E.foli К12 ВЕ783/РКС264.
А. EcoR I рестрикция гшадмиды РКС259.
Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28, с тем исклю7416
чёнием, что используют плазмиду рКС259 и EcoR I рестрикционный фермент с 10Х реакционной смесью (500 мМ NaCl, 1000 мМ трис-НСб, рН 7,5, 10 мМ MgClji), а не плазмиду pUR222 и Нае II рестрикцианный фермент с реакционной смесью. Полученные EcoR I рестрикционны.е фрагменты растворяют в 5//л мМ NaCl.
Б. EcoR I рестрикция плазмиды УЕр24 для последующего вьщеления 2 .
Выделяют плазмиду УЕр24 из E.coli К12 ВЕ1139/УЕр24 в соответствии с методикой примера 1. E.coli К12 ВЕ1139/УЕр24 представляет собой штамм, хранящийся в коллекции культур Северной региональной исследовательской лабораторий, Пеория, Иллинойс, под номером В-15022. Требуемое EcoR I переваривание плазмиды УЕр24 проводят по методике примера 29А. Полученные EcoR I рестрикцион- ные фрагменты растворяют в 5//л 5 мМ NaCl. В. Связывание и трансформация.
Плазмиду рКС259, обработанную EcoR I, и плазмиду УЕр24 (соответственно приготовленные в примерах 29А и Б) связывают и затем трансформирует в E.coli К12 ВВ783 по методике примера 28В. Трансформанты содержащие только желаемую, л.7,2кв придающую устойчивость к гигромици- ну В, апрамицину и С418 плазмиду, обозначают как Е.. coli К12 ВЕ783/рКС264. Такой трансформант традиционным образом отбирают, выра щивают на пластине, культивируют и используют для послед1тощих выделений плазмиды.
может быть связана в любом направлении, следовательно, плазмиду рКС264, как и плазм1вды с обрат- ной ориентацией, получают по указан ной процедуре. Различные плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко вьщелены и идентифицированы традиционными способами. Рестрикхщо ный участок и функциональная карта плазмиды рКС264 представлены на фиг.8.
-Пример 30. Конструирование плазмид рШ314 и pL0315 и трансформанты E.coli К12 BE783/PL0314 и E.coli К12 BE783/PL0315-.
А. Bgl II рестрикция плазмиды РКС259.
17
Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28В, с тем исключением, что используют плазмиду рКС259 и Bgl II рестрикционный.фермент с реакционной смесью, а не плазмиду pLP222 и Нае II рестрикционный фермент с реакционной смесью. Полученный в результате продукт Bgl II переваривания растворяют в 5 мМ NaCl
Б. Bgl II рестрикция плазмиды pSV5gpt.
, Рестрикцию проводят по методике примера 28В, с тем исключением, что используют плазмиду pSVSgpt и Bgl II рестрикционный фермент с реакционной смесью, а не плазмиду pUR222 и Нае I рестрикционньй фермент с реакционной смесью. Полученный продукт Bgl II переваривания растворяют .в 5 мМ NaCl,
В, Связывание и трансформация.
Связьгоание проводят по методике примера 28 В, с тем исключением, что используют Bgl II переваренные плазмиды рКС259 и pSVSgpt, а не плазмиды рКС261 и pUR222. Полученную связанную смесь используют для трансформации в E.coli К12 ВЕ783 (по методике трансформации Wensink 1974) на ТД- пластинах, содержащих 200 уйг/мл-антибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как видно из гель- электрофореза и других испытаний, содержат только требуемую плазмиду pL0314 или плазмиду pL0315. Такие трансформанты отбирают, выращивают на пластинках и культивируют. Они представляют собой требуемые трансформанты E.coli К12 BE783/PL0314 и E.coli К12 BE783/pL0315. Трансформанты используют для последующего выделения плазмид pL0314 и pL0315..
В результате получают рекомбинант- ные плазмиды двух ориентации, потому что ДНК-фрагменты связываются в лю- . бом направлении.
Требуемые плазмиДь легко различить и идентифицировать с помощью традиционных рестрикционного ферментативного и гель-электрофорезного анализа.
Линейную плазмиду рКС257 с Bgl окончанием связывают с-Bgl II пер варенной плазмидой pSV5gpt (приго товленной в примере ЗОБ) в соотве ствии с методикой примера ЗОВ. Св занную смесь используют для трансформации в E.coli К12 BE783 такж по методике примера ЗОВ. Полученн в результате трансформанты E.coli К12 BE783/pL0316 и E.coli К12- BE783/pL0317 используют для выдел
Рестрикционньй участок и функциональ- ния .плазмид рЬО316 и pL0317. Как
ная карта каждой из плазмид pL0314 и pL0315 представлены на фиг.9.
Пример 31. Конструирование клеток Мьшь Ltk /pL0314.
Конструкцию готовят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду
25017418
pL0314, а не рКС214. Сконструированные таким образом трансформанты Мьшь Ltk /pL0314 затем выращивают . в массовой культуре. 5 Пример 32. Конструирование клеток Мышь Ltk /pL0315.
Конструкцию получают по методике примера. 4, с тем исключением, что используют плазмиду pL0315, а не плазми 10 ду рКС214. Сконструированные таким образом Мышь Ltk /pL0315 трансформанты затем выращивают в массовой . культуре.
П р-и м е р 33. Конструирование 15 плазмид pL03l6 и рЬ0317 и трансформанты E.coli К12 BE783/pL0316 и E.coli К12 BE783/pL0317.
А. Sac I-рестрикция плазмиды рКС257 и добавление Bgl II связующих. ,
20
25
0
5
0
5
Рестрикцию проводят по методике примера 28Б, с тем исключением, что используют Sac I рестрикционный фермент -с 10Х реакционной смесью (600 мМ NaCl, 100 мМ тркс-ЕС1, рВ 7,4, 100 мМ MgCl), а не плазмиду pUR222 и Нае II рестрикционный фермент с реакционной смесью.
Добавление Bgl II связующих к Вас I переваренному окончанию плаз-- МИДЫ рКС257 проводят по известной методике. St. Jonhetal 1981, J. MOl. Biol. 152:317. Bgl II /d/kAFAIKTr/ и другие связзгющие являются доступными из Коллаборатив Рйсерч Инк., .1365 Мэн Стрит Вальтам, МЛ 02154.
Б. Связывание и трансформация.
Линейную плазмиду рКС257 с Bgl II окончанием связывают с-Bgl II переваренной плазмидой pSV5gpt (приготовленной в примере ЗОБ) в соответствии с методикой примера ЗОВ. Связанную смесь используют для трансформации в E.coli К12 BE783 также по методике примера ЗОВ. Полученные в результате трансформанты E.coli К12 BE783/pL0316 и E.coli К12- BE783/pL0317 используют для выделе ния .плазмид рЬО316 и pL0317. Как
и в примере ЗОВ, получают плазмиды двух ориентации, в зависимости от ориентации вставленного придающего устойчивость.фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко различны и идентифицированы традиционными способами. Рестрикци- -онный участок и функциональная карта
19 :1
плазмид pL0316 и pL0317 представлены на фиг.9.
Пример ЗА Конструирование клеток Мышь Ltk /pL03l6 и Мышь Ltk /pL0317.
Конструкции, каждую отдельно, J;OT вят по методике примерА 4, с тем исключением, что используют плазгмиды рШ316 и pL0317, а не плазмиду рКС21А. Сконструированные таким об- разом трансформанты Мьшь Ltk /pL0316 и Мьшь Ltk /pL0317 затем отдельно выращивают в массовой культуре.
Пример 35. Конструирование плазмид pL0318 и pL0319 и трансфор- манты E.coli К12 BE783/pL0318 и- E.coli К12 BE783/PL0319.
Конструкции готовят по методике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС 261, а не плазмиду рКС257. Трансформанты E.coli К12 BE783/PL0318 и E.coli К12 BE783/pL0319 используют для вьщеления плазмид pL0318 и pL0319. Как и в примере ЗОВ, получают плаз- МИДЫ двух ориентации, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Плазми- ды и полученные трансформанты легко различают и идентифицируют традици- онными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид pL0318 и pL0319 представлены на фиг.9-
Пример 36. Конструирование клеток Мышь .03l8 и Мышь Ltk /pL0319.
Конструкции готовят каждую отдельно в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что исполь- зуют плазмиды pL0318 и pL0319, а яе плазмиду рКС214. Сконструированные таким образом тшазмиды №ш1ь Ltk /pL0318 и Мьшь Ltk /pL0319 затем отдельно выращивают в массовой культуре.
Пример 37. Конструирование плазмид рЬОЗ20 И pL0321 и трансформанты Е. col Г КГ2 BE1041/PL0310 и E.coli К12 BE1041/pL0321.
Конструкции готовят по мет;0дике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС275, а не плазмиду РКС257. Получен1ше трансформанты E.coli К12 BE104l/pL0320 и E.coli К12 BE1041/PL0321 используют для выделения плазмид pL0320 и pL0321. Как и в примере ЗОВ, по74
20
лучают плазмиды двух ориентации, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты легко различают и идентифицируют традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид pL0320 и pL0321 представлены на фиг.9.
Пример 38. Конструирование клеток Мьшгь Ltk pLOC20 и Мьшь Ltk /pL0321.
Конструкции готовят каждую отдельно по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиды pL0320 и pL0321, а не цлазмиду рКС214. Сконструированные таким образом трансформанты Мьшь Ltk /pL0320 и Мьш1ь Ltk /pL0321 затем выращивают в массовой культуре.
Пример 39. Конструирование плазмиды рКС273 и трансформант E.coli К12 ВЕ783/рКС273.
А. Конструкция 2jiia ига ген-содер- жащей линейной ДНК с ВатН I и Sali окончаниями.
Инкубируют при в течение 1 ч, а затем 5 мин при около 5jun (5 г) плазмиды рУЕр24 в ТЕ-буфере, 5 АЛ ДТТ, 5 мл (1000 мг/мл) БСА, 25 jt/л воды, 5//л (5 единиц) Ват II рестрикционного фермента и 10Х реакционной смеси (1500 мМ NaCl, 60 мМ трис-HCl, рН 7,9, 60 мМ MgClj ) Охлаждают на льду ВатН I переваренную ДНК, осаждают этанолом, а затем растворяют в 30/И л вода, к которой прибавляют 5 jim 10Х указанной реакционной смеси, 5 л ДТТ, 5/ л (1000 мг/мл) БСА и. Sjun (5 единиц) Sal I рестрикционного фермента. По- лз генную смесь инкубируют при в течение 1 ч, затем при в течение 5 мин и, наконец, охлаждают до 4 С. Затем смесь экстрагируют из фенола и смесью хлороформ - изоамино вый спирт .(24:1), после чего осаждают этанолом. ПолучанНьй осадок содержит требуемую линейную ДНК. Её растворяют в 5 мМ NaCl и хранят при 4 С для дальнейшего использования..
.Б. Конструкция гена устойчивости к гигромицину В, содержащего линейную ДНК с ВашН I и Sal I окончаниями.
Линейную ДНК конструирзпот по методике примера 39А, с тем исключением.
211250
что используют плазмиду рКС2595 а не плазмиду УЕр24. Получают осадок, содержащий требуемую линейную ДНК. По- следнюю растворяют в 5 п 5 мМ NaCl и хранят при 4 С для дальнейшего не- j пользования.
В. Связывание и трансформация.
Связывание и трансформацию в Е.со- 11 К12 ВЕ783 проводят по методике примера 28В, с тем исключением, что Ш связывают фрагменты ДНК, приготовленные в примерах 39А .и Б, а не ; Нае II фрагменты плазмид pUR222 и рКС261. Их используют в последующих трансформациях. Некоторые из полу- 15 ченных трансформантов, как видно из гель-электрофореза и других тестов содержат требуемую плазмиду. Такой трансформант - E..coli KI2 I ВЕ783/рКС273 - отбирают, выращивают 20 на пластине, культивируют и исполь- . зуют для последующего вьщелекия плазмиды рКС273. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС273 представлена на фиг.10. 25
П р и.м е р 40. Конструирование клеток Saccharomyces cei-evisi- ае/рКС273.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивают в смеси 1%-ного дрожжево- зо го экстракта (2%-нь1й бактопептон) и 1%-ной глюкозы,, используя традиционные микробиологические процедуры. Трансформацию плазмиды рКС273 в дрожжи проводят по известной методике. 35 Hinnen et al. 1978, Prnc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929. Отбирают, трансформанты по их способности к росту в минимальной среде с недостатком ура- цила (ига фенотип) . Ura -трансфор- .40 м.анты последовательно испытывают на способность к росту в комплексной среде, дополненной 200.мг/мл гигро- мицина В. Такая доза является летальг ной для нетрансформированных клеток 45 Saccharomyces cerevisiae рКС273. Трансформантные клетки растут на - этих средах, тогда как нетрансформированные Saccharomyces cerevisiae- .цогибают..50
Пример 41. Конструирование плазмиды pL0378 и трансформант
E.coli К12 BE783/pL0378. А. Pst I рестрикция плазмиды pBR322. .- 55
Рестрикцию проводят по методике примера 28Б, с тем исключением, что , используют плазмиду рВР322 и Pst
17422
рестрикционный ферме.нт с 10Х реакционной смесью (500 мМ NaCl,60 мК трис НС1, рН 7,4, 60 MMKgCljj) ,а не плазмиду pUR222 и Нае II рестрикционный фермент I с реакционной смесью. Полученный продукт Pst I-переваривания растворяют в 5 мл 5 мМ NaCl.
Б. Pst Т рестрикция плазмиды РКС264.
Рестрикцию проводят по методике примера 4ТА, с тем исключением, что используют плазмиду рКС264, а не плазмиду рВР322. Полученный продукт Pst I переваривания растворяют в 5 «л 5 мК NaCI, . Г
В. Связывание и трансформация.
Связывание и трансформацию E.Coli К12 ВЕ783 проводят по методике рри- мера 28Б, с тем исключением, что свя зывают фрагменты ДНК, приготовленные в примерах 41А и Б, а не Нае Ц фрагменты плазмид pUR222-H рКС261, и используют для последующей трансформации. Некоторые из т рансфррмантов, как показывает антибиотический о.т бор, гель-электрофорез и другие испытания, содержат треб уемую плазмиду. Такой трансформант - E.coli К12 ВЕ783/рЬ0378 - отбирают, выращивают на пластине, культивируют и используют для последующего вьщеления плазмид рЬ0378.
Как и в примере ЗОВ, получают плазмиды двух ориентации, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Следовательно, в дополнение к плазмиде pL0378, указанная процедура также генерирует плазмиды с обратной ориен тацией. Эти плазмиды и полученные трансформанты легко различить и идентифицировать традиционными способами. ;.. .
Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды pL0378 представлены на фиг. 10. Пример 42. .Конструирование клеток Saccharomyces cerevisiae pL0378,
Трансформацию проводят по методике примера 40, .с тем исключением, что используют плазмиду pL0378, содержащую ген устойчивости к G418 а не плазмиду рКС273. Трансформанты идентифицируют традиционным скринингом реципиентных клеток дрожжей на нали23 .125017424
чие плазмиды ДНК. Таким образом, же- cerevisiae pL0378 легко идентифици- лаемые трансформанты Sacch(iiromyces руются и выделяются.
Таблица 1
+- рост есть;
- - отсутствие ростаi
N/T - испытание не проводилось.
Тип клеток
Таблица 2
Концентрации антибиотика в культуральной среде, .
ECO Ват HI
Pvull
PY
Hindlll
BglJI ffPt
- sw ,2
PY
Hinctni
Bam HI
ECO RI Bam HI
I pKC2f
inoKb)
Pvu H
Hindllf
Sail egtil EcoKl
-sv«o
фиг.
НМ-Ш
ВатШ
egtil
со . Вот HI
Pvull
mrrd/a Qgiji Sail
HindJIl
Bom HI
BglJl
ECO Kl
py
EcoRIHindM
Xhol фиг.
PstI
Bglll Aval
pHC22i 6.8 Hb
PstI, -EcoKI
Sod )(hollAval)
BstEll Sad PstI
Bgin Aval
dglJl
Pstl.PyuI
Sod
EcoRI
Sod
EcoRI
Sail
Sad
Ha ell oeff
coKi Pstl,Pvul
Ho ell
фцг.6
Sad
фигЛ
Haell
HaeJ
Xhol
EcoRl PstJ,PYUl
Pstl.Pvul
Psil
EcoKl Hind/If
.8
2
Hoell f/J/
&/
PsU
fiol
EcoKI
P
co l Se /ae//
co/fl Ж f/oe//
co/fI aW
EC OKI
pffC253
рнсг57
tffL0320h7 9f b) 2.pL03l8{ -f2.5/(b)
фиг. 9
фиг.Ю
Редактор Н.Егорова
Составитель Л.Чибисова
Техред Н.Бонкало Корректор А.Зимокосов
Заказ 4341/60 Тираж 490 , Подписное ВШШПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москвй, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
