Штамм @ @ @ 9-тест-культура для определения @ -фенилаланина Советский патент 1986 года по МПК C12P13/22 C12R1/38 C12P13/22 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, являющегося тест- культурой для определения L-фенил- алзнина.

Целью изобретения является получение нового штамма Pseudomonas species М9 специфичного и чувствительного к содержанию L-феншталаника в среде, с помощью которого можно выявлять продукцию L-фенилаланина, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу жидких и агаризованных ральных средах среди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты (этанол и метанол) в качестве источника углерода и энергии.

Предлагаемый штамм Pseudomonas species М9 получен с помощью мутагенеза N-мeтил-N -нитро-Ы-нитро- зогуанидином и является ауксотроф- ным фенилаланинзависимым мутантом штамма дикого типа Pseudoraonas species, выделенного из сточных вод Минского завода медпрепаратов.

Щентификадию мутации бактерий Pseudomonas species М9 ствляли по отсутствию способности расти на минеральных средах без L-фенилаланина. 1 1инимальная концентрация Ь-фенилаланина, обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жийких и агаризованных минеральных средах, соответствует 0,5 мкг/мл.

Штамм Pseudomonas species М9 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика (Москва), № В-3244.

Pseudomonas sp. М9 имеет следующие характеристики.

Морфологические особенности штамма. Клетки прямые палочков1- дной формы с округленными концами, 0,6 2-3fJ подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.

Культуральные признаки. Колонии на агаризованных питательных средах (мясо-пептонном агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, крупше, край ровный, серовато-белые. Через 24 ч при 28°С образуют колонии размером 210

15

20

25

30

35

40

45

50

Хорошо растет на минеральных сре дах простого состава, дополненных L-фенилаланином, и не нуждается в добавлении ростовых факторов и друг аминокислот.

Физиолого-биохимические признаки По отношению к кислороду - облигат- ньм аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 0, рН среды в пределах 6,8-7,8. Азот утилизирует в виде со лей аммония, мочевины, нитратов.

Пигменты. Образует желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на Кинг Б агаре. Внутриклеточного пигмента не образует.

Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес-Прос- кауэра отрицательная. Индол не обра зует. Тест на аназробнзто аргинин-де гвдролазу положительньй. Реакция на анаэробную денитрификацию отрицательная. Лецитиназная активность от сутствует.

Не гидролизует крахмал,желатин Твин-80.

В качестве источников углерода используют глюкозу, глицерин, сахарозу, галактозу, мальтозу, фруктозу этанол, метанол, тирозин, фенилала- нин, орнитин, глицин, лейцин, глю- таминовую кислоту, аспарагиновую кислоту. Не утилизирует арабинозу, маннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целло- биозу, инозит, серин, лизин, трипто фан, антраниловую кислоту, ацетамид

Штамм идентифицирован как Pseudo monas species согласно определителю Bergey. .

Пример 1. Определение про дукции L-фенилаланина с помош;ью тест-культуры Pseudomonas species М9 производят следующим образом. Делаю посев культуры Pseudomonas species М с косяка в МПБ (мясо-пептонный бульон) либо другую питательную среду, обеспечивающую рост бактерий и культивируют в течение 10-12 ч пр . Затем бактериальные клетки отмывают дважды физиологическим раствором с помощью центрифугирования (10 мин, 3000g) и ресуспенди- руют до первоначального объема в .этом же растворе, 0,1 мл суспензии клеток вно;сят в пробирку с 4 мл рас

3 мм. Рост по уколу в НПА умеренный, 55 плавленного и охлажденного до в основном на поверхности среды, В минимального полужидкого агара жидких питательных средах образует (0,7%), приготовленного на основе интенсивную муть.минеральной среды, содержащего в

5

0

5

0

5

0

45

50

Хорошо растет на минеральных средах простого состава, дополненных L-фенилаланином, и не нуждается в добавлении ростовых факторов и других аминокислот.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - облигат- ньм аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 0, рН среды в пределах 6,8-7,8. Азот утилизирует в виде солей аммония, мочевины, нитратов.

Пигменты. Образует желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на Кинг Б агаре. Внутриклеточного пигмента не образует.

Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес-Прос- кауэра отрицательная. Индол не образует. Тест на аназробнзто аргинин-де- гвдролазу положительньй. Реакция на анаэробную денитрификацию отрицательная. Лецитиназная активность отсутствует.

Не гидролизует крахмал,желатин Твин-80.

В качестве источников углерода используют глюкозу, глицерин, сахарозу, галактозу, мальтозу, фруктозу, этанол, метанол, тирозин, фенилала- нин, орнитин, глицин, лейцин, глю- таминовую кислоту, аспарагиновую кислоту. Не утилизирует арабинозу, маннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целло- биозу, инозит, серин, лизин, триптофан, антраниловую кислоту, ацетамид.

Штамм идентифицирован как Pseudomonas species согласно определителю Bergey. .

Пример 1. Определение про дукции L-фенилаланина с помош;ью тест-культуры Pseudomonas species М9 производят следующим образом. Делают посев культуры Pseudomonas species М9 с косяка в МПБ (мясо-пептонный бульон) либо другую питательную среду, обеспечивающую рост бактерий, и культивируют в течение 10-12 ч при . Затем бактериальные клетки отмывают дважды физиологическим раствором с помощью центрифугирования (10 мин, 3000g) и ресуспенди- руют до первоначального объема в .этом же растворе, 0,1 мл суспензии клеток вно;сят в пробирку с 4 мл раскачестве источника углерода глюкозу (в концентрации 0,2%), и наслаивают вторьи слоем на поверхность агаризо- ванной среды (1,5%) того же состава. После застьшания верхнего слоя с культурой уколом делают посевы отдельных клонов испытуемых «а продукцию L-фенилаланина культур микроорганизмов, утилизируюищх в качестве источника углерода и энергии глюкозу (по 20-30 клонов на чашку Петри). Пробы выращивают в течение 24-48 ч при 28-30°С. Вокруг колоний, клетки которых продуцируют Ь-фенилалан 1Н, наблюдаются четкие, интенсивные зоны роста индикаторной тест-культуры Pseudoraonas sp. М9, размеры которых зависят от количества синтезируемого L-фенилаланина.

П р и м е р 2. Посевной материал тест-культуры Pseudomonas sp. М9 к последуювще процедуры производят как в примере 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энергии в используемые мине- ральные среды добавляют вместо глюкозы этанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на продукРедактор Л. Повхан Заказ 4687/29

Составитель И. Афанасьева - .

Техред М.Ходанич Корректор Л. Пилипенко

Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4,

цию L-фенилаланина культл5 микроорганизмов, утилизирую Щ1х этанол.

Пример 3. Посевной материа тест-культуры Pseudomonas sp. М9 и последзпощие процедуры производят, как в примере 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энергии в используемые минеральные среды добавляют метанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на продукцию L-фенилаланина культур микроорганизмов, утилизирующих метанол. Пробы выращивают в течение 48-72 ч.

Штамм Pseudomonas sp. М9 являетс мутантом по Phe-гену,-что обеспечивает его потребность и высокую специфичность по отношению к L-фенял- аланину. С помощью штамма Pseudomonas sp. М9 можно выявлять и изучать содержание Ь енилалаиина, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу минеральных средах среди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирукнцих низшие спирты (этанол и метанол) в качестве источников углерода и энергии.

Штамм Pseudomonas species М9 (коллекция музея культур промышленных микроорганизмов Института ВНИИ- генетика, коллекционный номер В-3244) - тест-культура для определения L-фенилаланина. СП 4 О