Штамм @ @ @ 7-тест-культура для определения @ -тирозина Советский патент 1986 года по МПК C12P13/22 C12Q1/02 C12R1/38 C12P13/22 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нрвого штамма, являющегося тест-культурой для определения продукции L- тирозина.

Целью изобретения является получение нового штамма Pseudomonas species М7 специфичного и чувствительного к содержанию Ь тирозина в среде с помощью которого можно выявлять t-тирозйк, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу жидких и агаризо- ванных минеральных средах среди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низпше спирты (этанол или метанол) в качестве источника углерода и энергии

Предлагаемьй штамм Pseudomonas sp. М7 получен с помощ:ью мутагенеза .М-метил-К -нитро-К-нитрозогуанидином и является ауксотрофным тирозинаави- мутантом штамма дикого типа Pseudotnonas sp. М, выделенного из сточных вод Минского завода медпре- паратов.

Идентифи1 ацшо мутации зависимости по тирозину (TYR) у бактерий Pseudomonas sp. М7 осуществляли по отсутствию способности растя на минеральных средах без L-тирозина. Минимальная концентрация L-тирозина, обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жидких и агаризоваиных минеральных средах, соответствует 0,5 мкг/мл.

Штамм Pseudomonas sp. М7 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов ВНШгенетика (Москва) № В-3245.

Штамм Pseudornonas sp. М 7 имеет следующие характеристики.

.Морфологические особенности штамма. Клетки прямые, палочковидной фор- с округленными концами 0,6х2-3р. подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.

Культуральные признаки. Колонии на агаризованных питательных средах (мясо-пептонном агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, круглые, край ровный, серовато-белые. Через 24 ч при 28°С образуют колонии размером 2 - 3 мм. Рост по уколу в Ш1А умеренный, в основном на поверхности среда:. В жидких питательных средах образует интенсивную муть.

Хорошо растет на минеральных средах простого состава, дополненных Lтирозином, и не нуждается в добавлении ростовых факторов и других аминокислот.

Физиолого-бкохимическйе Признаки.

По отношению к кислороду - облигатный аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 С, рН среды в пределах 6,8-7,3. Азот утилизирует в виде солей аммония, мочевины, нитратов.

Пигменты. Образует желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на Кинг В агаре. Внутриклеточного пигмента не образует.

Реакция на оксидазу и каталазу поs ложительная. Реакция Форес-Проскауэра отрицательная. Индол не образует. Тест на анаэробную аргинин-дегидрола ЗУ положительный. Реакция на анаэробную денитрификацию отрицательная.Ле0 цитиназная активность отсутствует.

Не гидролизует крахмал, желатин, Твин-80.

В качестве источников углерода использует глюкозу, глицерин, сахарозу,

5 галактозу, мальтозу, фруктозу, этанол, метанол, тирозин, фенилаланин, орни- тин, глицин, лейцнн, глютаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту. Не утилизирует арабинозу, маннозу, ксило-. зу, лактозу, маннит, раффинозу, дуль- цит, сорбит, целлобиозу, инозит, се- рин, лизин, триптофан, антраниловую кислоту, ацетамид.

Штамм идентифицирован как Pseudomonas sp, М7 согласно определителю Bergey.

Пример 1. Определение L-тирозина с помощью тест-культуры Pseudomonas sp. М7 производят следующим образом. Делают посев культуры Pseudomonas sp. М7 с косяка в МПБ (мясо- пептонный бульон), либо в другую питательную среду, обеспечивающую рост бактерий, и культивируют в течение

, ночи при 28°С. Затем бактериальные клетки отмьгоают дважды физиологическим раствором с помощью центрифугирования (10 мин, 5000 g) и ресуспен- дируют до первоначального объема в этом же растворе. 0,1 мл суспензии клеток вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45°С минимального полужидкого агара (0,7%), приготовленного на основе минеральной среды М9, содержащего в ка55 честве источника углерода глюкозу (в концентрации 0,2%); и наслаившот вторым слоем на поверхность агаризован- ной среды (1,5%) того же состава.Пйс0

5

0

ле застывания верхнего слоя с культурой уколом делают посевы отдельных клонов испытуемых на продукцию L-ти- розина культур микроорганизмов, ути- 1изирующих в качестве источника угле рода и энергии глюкозу (по 20-30 клонов на чашку Петри). Пробы выращивают в течение 24 - 48 ч при 8-30°С. Вокруг колоний, клетки которых продуцируют Ь-тирозин, наблюдаются четкие, интенсивные зоны роста индикаторной тест-культуры Pseudomonas sp, М7, размеры которых зависят от количества синтезируемого L-тирознна.

Пример 2. Посевной материал тест-культуры Pseudomonas sp. М7 и последующие процедуры производят по примеру 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энер- гии в используемые минеральные среды добавляют вместо глюкозы этанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на содержание Ь-т:тирозкна культур микроорганизмов, утилизирую-, щих этанол.

Редактор Л. Повхан Заказ 4687/29

Составитель Н. Афанасьева

Техред М.Ходанич Корректор Л. Пилипенко

Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,-д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

П р и м е р 3. Посевной материал тест-культуры Pseudoraonas sp. М7 и последующие процедуры производят по примеру 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энергии в используемые минерапьные среды добавляют метанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на содержание L-тирозина культур микроорганизмов, утилизирующих метанол. Пробы выращивают в течение 48-72 ч.

Штамм Pseudomonas sp. М7 является мутантом по TYR-гену, что обеспечивает его потребность и высокую специфичность по отношению к L-тирозину. С помощью штамма Pseudomonas sp. М7 можно вьювлять и изучать продукцию L-тирозина, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу минеральных сре дах среди различных групп MiiKpoopra- низмов, в том числе ассикилирунщих низшие спирты (этанол или метанол) в качестве источников углерода и энергии.

Штамм Pseudomonas species М7 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института ВНИИгенетика, коллекционный номер В-3245) - тест-культура для определения L-тироэина. ю СП