Штамм @ @ @ -тест-объект для определения продукции @ -триптофана Советский патент 1985 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/38 

1 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, являюшегося тест-объектом для определения продукции L-триптофана.. Целью изобретения является получение нового штамма Pseudomonas Species МЗ, высоко специфичного и чувствительного по отношению к L-триптофану, с помощью которого можно выявлять продз сцию последнего, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу жидких и агаризованиых минеральных средах (не содержащих дополнительно каких-либо ростовых факторов), сре ди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты (этанол и метанол) в качестве источников углерода и энергии. Предлагаемый штамм Pseudomonas Species МЗ получен с помощью, мутагенеза Ы-метил М-нитро-М- нитрозогуаиидином и является ауксотрофным триптофанзависимым мутантом (имеет мутацию в trpB-локусе) щтамма ди кого типа Pseudomonas Species М, вьщеленного из сточных вод Минского завода медпрепаратов. Идентификацию trp В-мутации у бактерий Pseudomonas species МЗ осуществляли по отсутствию способности роста на антраниловой кислоте и индоле, добавленных в среду вместо L-триптофаиа, а также биохимически по утрате активности Ь-субъедиииць1 фермента триптофансинтазы (КФ. 4.2.1.20). Рост клеток штамма Pseudomonas species МЗ на минеральных средах без Ь-триптофаиа полностью отсутствует. Минимальная кон центрация L-триптофана, обеспечивающая рос : бактерий в жидких и агаризованных минеральных средах, соответствует 0,5 мкг/мл. Штамм Pseudomonas Species МЗ хранится в Центральном музее промышленных микро ганизмов ВНИИГенетика (Москва), N В-30 Штамм Pseudomonas Species МЗ имеет следующие характеристики. Морфологические особенности штамма. Клетки прямые, палочковидной формы с округленными концами, 0,6x2-3 /14 , подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, грамотрицательные, слор не образуют. Культуральные признаки. Колонии на агаризованных питательных средах (мясо-пептонном агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, круглые, край ровный, серовато-белые. Через 24 ч при 28С образуют колонии р мером мм. Рост по уколу в МПА умеренный,в основном на поверхности среды. В жидких питательных средах образует интенсивную муть. Хорошо растет иа минеральных средах простого состава, дополненных Ь-триптофа42ном, и не нуждается в добавлении ростовых факторов и аминокислот. Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - облигатный аэроб. Оптимальная температура роста 28-ЗО С, рН среды в пределах 6,8-7,3. Азот утилизирует в виде солей аммония, мочевины, нитратов. Пигменты. Образует желто-зеленый водорастворимый флюоресцируюидий пигмент на Кинг В агаре. Внутриклеточного пигмента не образует, у Реакция на оксидазу и каталазу положительная. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Индол не образует. Тест на аназробиую аргинин-дегидролазу положительный. Реакция на анаэробную денитрификацию отрицательная. ЛецитИназная активность отсутст: вует.; Не гидролизует крахмал, желатин, Твин-80. В качестве источников углерода использует глюкозу, глицерин, сахарозу, галактозу, мальтозу, фруктозу, этанол, метанол, тирозин, феиилаланин, орнитин, глицин, лейцин, глютаминовую кислоту, аспарадиновую кислоту. Не утилизирует арабинозу, маннозу, ксилозу, лактозу, маннит, раффинозу, дульцит, сорбит, целлобиозу, инозит, серий, лизин, триптофан, антраниловую кислоту, ацетамид. Штамм идентифицирован как Pseudomonas species согласно определителю Bergey. Пример. Определение продукции L-тршгтофана с помощью тест-объекта Pseudomonas species МЗ производят следующим образом. Делают посев культуры Pseudomonas species МЗ с косяка в МПБ (мясо-пептонный бульон), либо в другую питательную среду, обеспечивающую рост бактерий, и культивируют в течение ночи при 28°С. Затем бактериальные клетки отмывают дважды физиологическим раствором с помощью центрифугирования (10 мин, 5000 g) и ресуспендируют до первоначального объема в этом же растворе. 0,1 мл суспензии клеток вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45°С минимального полужидкого агара (0,7%), приготовленного на основе минеральной среды М9, содержащего в качестве источника углерода глюкозу ( в концентрации 0,2%) и наслаивают вторым слоем на поверхность агаризованной среды (1,5%) того же состава. После застывания верхнего слоя с культурой тест-объекта уколом делают посевы отдельных клонов испытуемых на продукцию L-триптофана культур микроорганизмов, утилизирующих в качестве источника углерода и энергии

глюкозу (по 20-30 клонов на чашку Петри) . Пробы выращивают в течение 24- 48 ч при 28-30°С. Вокруг колоний, клетки которых продуцирует L-триптофан, наб-. людаются четкие, интенсивные зоны роста

тест-культуры Pseudomonas species МЗ, размеры котррых зависят от количества синтезируемого Ь-триптофана.

Пример 2, Посевной материал тест-культуры Pseudomonas species МЗ и по.следующие процедуры производят как в примере 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энергии в используемые минеральные среды добавляют вместо ГЛ1РКОЗЫ этанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на продукцию L-триптофа культур, микроорганизмов, утилизирующих зтанол.

Пример 3. Посевной материал тесткультуры Pseudomonas species МЗ и последующие процедуры производят как в примере 1, за исключением того, что в качестве источника углерода и энергии в используемые минеральные среды добавляют метанол (в концентрации 1%) и делают посевы испытуемых на продукцию Ь-триптофат культур микроорганизмов, утилизирующих метанол. Пробы выращивают в течение 48-72 ч.

Штамм Pseudomonas Species МЗ HBjfketся мутантом по гену, что обеспечивает его потребность и высокую специфичность по отнощению к L-триптофану. С помощью штамма Pseudomonas species МЗ можно выявлять и изучать продукцию Ь-триптофана, начиная с 0,5 мкг/мл, на простых по составу минеральных средах среди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты (зтанол и метанол) в качестве источников углерода и энергии..

Штамм Pseudomonas Species МЗ - . (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института ВНИИГенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-3037) - тест-объект для oiqjeделения продукции L-триптофана.