Штамм бактерий РSеUDомоNаS Sp., используемый в качестве тест-культуры для определения никотиновой кислоты Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 C12N1/20 C12Q1/00 C12N1/20 C12R1/38 

fjobpt то tic (1ТНОС1ТГЯ к микробно- логичегnfOMibuicHHocTH и касается

НОРТГО ij 1пм i i ж i ep« и, являющегося

тест-м г

Д К U

Р)

jj ИМ (

цифк in i i и ниш i HI )T,u(

, тя оиредепения про- 1Н1 в и кипстч (витамина

fp i J-M чиаяется новый ри i Росчк1( sp. , спе- i i гяитс ьный к содержа- i гис тоты в среде, с можно выявчять продукчм) и it-Hi i трои кипоты, начиная f U, 1 i i, i по составу

жидких и агаризованних минеральных средах у различных rpvnn ьшкроорга- низмов, в том чиспе ассимилирующих низшие спирты (этано i н метанол) в качестве источника тлерода и энергии.

Штамм получен с помощью нитрозогуанн- дина и является а ксотрофным по HHKOTII- новои кислоте мутаьтом итамма дикого типа Pscudomonas sp. M, выделенного из сточных вод Минского тавода медпрепа- ратов,

Идентификацию чуг щин nad у бактерии Pseudomonab чр. , осуцествляли по

сл

со

СЛ

00 СО

со

отсутствию способности расти на минеральных средах без никотиновой кислоты Минимальная концентрация никотиновой кислоты, обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жидких и агаризованных минеральных средах, составляет 0,1 мк г/мл.

Штамм Pseudomonas sp. (лабораторный номер М1 Охранят в лиофилизированном состоянии.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-3834 и имеет следующую характеристику.1

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы с округлыми концами 0,6x2-3 мкм, подвижные с 2-4 монополярными жгутиками, 2 граммотрицательные, спор не образуют.

Колонии на агаризованных питательных средах (мясопептонном агаре, Кинг В агаре) гладкие, плоские, круглые, серовато-белые с ровными краями. Че- 2 рез 24 ч при 28°С образуют колонии 2- 3 мм диаметром. Рост по уколу в МПА умеренный, в основном на поверхности среды, В жидких аитательных средах образует интенсивную муть.

Хорошо растет па минера.1 .т с простоте состава, дополнен пх и -г п- новой кислотой.

Физиолого-бнохнмичрсчне п. nv-f кн

Отн щение к источникам угл т;д ИСПОЛЬЗУЮТ глюкозу, ГЛИЦЕРИН сяхаро- зу, галактозу, мальтозу, фрух-. зз, этанол, метанол, тирозин, Фенч.палажш, орнитин, глицин, лейцин, глютаминовую

кислоту, аспарагиновуп кислоту. Не

утилизирует: арабиночу, маннозу, ксилозу, лактозу, манннт, раффинозу, дульцит, сорбит, целлобиозу, инозит, серии, чизин, триптофан, антраниловую кислоту, ацет амид.

Отношение к источникам азота: использует аммонийный,нитратный азот, мочевину.

Реакция на оксидазу и каталазу попожительнгчя. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Индол не образует. Тест на анаэробную аргинин-дегидра- лазу положительный. Реакция на анаэробную денитрификацию отрицательная. Лецитиназная активность отсутствует.

Не гидролизует крахмал, желатин. Твин-80.

Образует желто-зеленый водорастворимый флюоресцирующий пигмент на сре

0

0

5

де Кинг В. Внутриклеточного ш iмонта не образует.

Облигатный аэроб.

Оптимальная температура роста 28- 32°С.

Оптимальный рН 6,8-7,3. Штамм Pseudomonas sp. В КПП В-3834 может быть использован п качестве индикаторной тест-культуры для качественного и количественного определения продукции никотиновой кислоты на ai a- ризованных и в жид; их гредгу. la агаризованных средах можно пр н«водить только качественное определение продукции никотиновой кислоты л в -шд- ких средах - качественное v к v-it-cr- веннпе.

Проведенный :-з -зс ви имисг еж- ду величиной зоны гч г-н;;и .аторко- го штамма 1 Fiud im , ,р. BKQM n-38 на агЈ1ризованно11 -,емр : )L TII.LI количеством ыкс гиновин кислоты поч- вопил установить, -IT ье нчина золь. ипдикг тор 1ой культуры В1. прямо пропорционально количества никотиновой кислоты топько в очень узком диапазоне кон /.о1 (рации, а пиенно от О , 1 до 0 , Z мк м..

Гезультт 11 мпоп еле гующие : Кстн Ч Сг, .о ii-OTri- Ди-iMei:) зоны, f i киг поты, см чг/мл

ОО

0,05О

0,101 ,3

0,15,0

0,202,9

0,253,7

0,30/.,5

0,354,з

0,404,5

0,454,5

О,504,5

Никотиновая кислота в количестве 0,3 мкг дает максимальный pjшер зоны роста индикаторного штамма нл лгаризо- ванной среде (4,5 см). Дальне tmee увеличение количества нпкотинопи i кислоты уже не приводит к возрастанию размеров зоны.

В дипазоне 0.1-0,3 мкг/мл никотиновой кислоты можно проследить прямо пропорциональную зависимость увепиче- нил размеров зоны ростл индикаторной тест-культуры от количества никотиновой кислоты.

Однако даже в диапазоне размеры зоны роста индикаторной гегт-кульгуры нл агари нжаннои среде MOI ут варьировать и (агшоимости от пчотнос- ти и марки aiара и других факторов. Поэтому для и- чения продукции никотиновой кислоты на тотных гредах рекомендовано игпо ть юват ь шгамм только для качественного аначиза, причем

1ФО,ГУМ ) id , In Г), г 1 . , r;,irh,)ЛП10

per HI , он i 14 ии, i ч и а« 0,1 кг/м .

При римент a .еч ан лизе зависимое 1 i размеров if ны роста индикатора го пта П ч or -ч о лико- ТЦН0130П 1Л к ты при HI почьзовалии агари i о ачннх сред, О ) лцнх н качестве lor .и / порота и эчер чи этанол ил мг i ню , i л т ( ь i, i диапазон, в хотгм ом 2 HMO ra т -( п in ииона.г, ьлая saB iCi.-M. r p ir- epa i i от количества

ч, , гмм о т ткои же, i : i i. ь i г, и находит- (. i -С , ( . -эазмеры 11 ичч(. -о при исникот1 чорон t- как н ИР ,. pi т; я л npe,;t -ax зон iа: о и е

почьзопадии ope i L ко оч:и ом зоны роста индш л орпог гм 1мма необходимо ре-25 гистриропап н, СУГЬИ поз е.

В ,am,K - спедах с номо Ц о штамма ВКГИ B-JSJ i моя но проводи ib качествен- ниг п го тичес ненное определение про- л i д и на

и

не

( г

ь

i

:HV

. I 1 Г

II I 1

rer i i

i С ВО fllK il I

.. |Г D Tj (, , (Ч )

Ч JL OH , 14 ( .

иг o ji /s i нием

Ha MI. ) г -о и i на я v иг у i n п м i Si d i i vi , цечно ( миг

КО--ОИ (О iV) Ь / нК Г НН I и I HfOh

iHUMi i 1ч )тп. Кач- i т- 30 чи oci i rn тяю i утем . i. -л, i п.мм mv i и () 1 i я /-и ч мчнораль- 1 of i. I M i, i ее пробы, it л ,к , Коли- чо i ч пробе ), ч м HOI-i ..анпи опти1 : ль урь- с i( ч. i ли о графика

35

(Illl5«

ч р . п i , ( iii р,к телие 1,ико- T.iHHHM кис ii --ы на ai ризованапх срс- т % , Лелают посев итамма с косяка п МЛБ либо другую питательную среду, обеспечивающую рост ( актерии, и куль- гиниг . ют в течение ночи при 28 С. Чатег оактерии отю.шают ТРЯЖДЫ физиологическим растнором с помощью центри сЬугироьания (10 мин, 5000 g) и ресус- пендируют до червоначатьного объема в этом же растворе, 0,1 мл суспензии клеток вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45°С миннмальж полужидкого агара (0,7%) приготовленного на основе минеральной среды М9 следующего состава, %: пкжоы 0,2; На2НР04 (безводный) 0,6; . 0,3; NaCl 0,05; 0,1; СаС) 0,0015; MgS047Н20 0,2;рН7,0. Засеянную среду наслаивают вторым сдоем на поверхность агаризованной среди (1,5%) того же состава. После застывания верхнего слоя с культурой индикт орного штлммт уколом делчют г1 епы отдельных кпонов испытуемых .ia продукцию никотиновой кислоты микроорганизмов, утилизирующих в качестве источника углерода и энергии глюкозу. Пробы вмрацивают в течение 24-48 ч при 28°С. Вокруг колонии, клетки которых продуцируют

1 } С1 L 1

( К 1И П I

ка иброяоч- 40 ЫИКОТИИОВУЮ кислоту, наблюдаются чстГНиС ГП LIT3M-р. 1 К1Ш Ь-1834, выра- тьнсчЧ с ос т,с М9 с глюкие 3OHi.i роста индик 1торного штамма. ВКПМ B-J834.

Пример 2. Посевной материал тест-культуры и последующие процедуЗсвьсимосги от концен1м.ц к чогы в среде. 45 ры Па°ДЯТ аналогично примеру 1,

ь ия i luni нмссть нарас- однако в качестве источника углерода

8956

Таким образом, г использованием штамма ВКПМ B-J8J4 в жидкой среде можно проводить качественный и количественный анапш определения продукции (содержания) никотиновой кислоты в диапазоне концентрации 0,1 - 1 ,0 мкг/мл.

5

ч р . п i , ( iii р,к телие 1,ико- T.iHHHM кис ii --ы на ai ризованапх срс- т % , Лелают посев итамма с косяка п МЛБ либо другую питательную среду, обеспечивающую рост ( актерии, и куль- гиниг . ют в течение ночи при 28 С. Чатег оактерии отю.шают ТРЯЖДЫ физиологическим растнором с помощью центри- сЬугироьания (10 мин, 5000 g) и ресус- пендируют до червоначатьного объема в этом же растворе, 0,1 мл суспензии клеток вносят в пробирку с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45°С миннмальж полужидкого агара (0,7%), приготовленного на основе минеральной среды М9 следующего состава, %: пкжоы 0,2; На2НР04 (безводный) 0,6; . 0,3; NaCl 0,05; 0,1; СаС) 0,0015; MgS047Н20 0,2;рН7,0. Засеянную среду наслаивают вторым сдоем на поверхность агаризованной среди (1,5%) того же состава. После застывания верхнего слоя с культурой индикт орного штлммт уколом делчют г1 епы отдельных кпонов испытуемых .ia продукцию никотиновой кислоты микроорганизмов, утилизирующих в качестве источника углерода и энергии глюкозу. Пробы вмрацивают в течение 24-48 ч при 28°С. Вокруг колонии, клетки которых продуцируют

кие 3OHi.i роста индик 1торного штамма. ВКПМ B-J834.

Пример 2. Посевной материал тест-культуры и последующие процеду

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, являющегося тест-культурой для определения никотиновой кислоты. Целью изобретения является новый штамм бактерий PSEUDOMONAS SP. ВКПМ В-3834, специфичный и чувствительный к содержанию никотиновой кислоты в среде, с помощью которого можно выявлять продукцию никотиновой кислоты, начиная с 0,1 мкг/мл, на простых по составу жидких и агаризованных минеральных средах у различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующих низшие спирты /этанол и метанол/ в качестве источника углерода и энергии. Минимальная концентрация никотиновой кислоты, обеспечивающая рост бактерий этого штамма в жидких и агаризованных минеральных средах, составляет 0,1 мкг/мл. На агаризованных средах можно проводить только качественное определение продукции никотиновой кислоты, на жидких - качественное и количественное. В жидких средах прямо пропорциональная зависимость роста штамма от количества никотиновой кислоты в среде наблюдается в диапазоне концентраций последней 0,1 - 1,0 мкг/мл. 1 ил., 1 табл.

к

Ml

-1

r

Ч,-т,, ИЧОГТИ ОТ

, )i t i ( , ICFu H КИСЛОТЫ В

i в ч япа с не 0.1 . I1 № I РНы. I РРГИИ НИКОТИj D , 0 MKF мл челтгчина ОП540 MI; мплыгпго значения и

гри да ,т i i плеч ч не гнчени концентра- rv1 H4t 41 по;1 t-ис юты изменений

HI

Н 1 lip Ml

( in кучьтуры че бснее высоком содерi .(слоты кочичест- и при цении проСы.

0

5

и энергии з используем т минеральные среды добавляют вместо глюкозы 1% этанола. Уколом делают посевы культур микроорганизмов, типизирующих этанол, определяя по росту вокруг укола штамма ВКЛМ В-3834 образование никотиновой кислоты.

Пример 3. Посевной материал штамма и последующие процедуры проводят как в примере 1, однако в качестве источника углерода н энергии в используемые минерачьные среды добавляют 1% метанола п делают посевы

испытуемых на продукцию никотиновой кислоты культур микроорганизмов, утилизирующих метанол. Пробы выращивают в течение 48-72 ч.

Пример 4 . Определение продукции никотиновой кислоты в жидких средах. Посевной материал штамма ВКПМ В-3834 готовят как в примере 1. Затем 0,1 мл посевного материала вносят в пробирку с 4 мл жидкой минеральной среды М9, содержащей в качестве источника углерода 0,2% глюкозы и 1 мл пробы (культуральной жидкости испытуе- Mdro штамма-продуцента, полученной после культивирования в жидкой среде .и последующего осаждения клеток с помощью центрифугирования при 5000 g в течение, 10 мин). Пробы выращивают в течение 24-48 ч при 28°С. Наличие никотиновой кислоты в пробе, а также ее

П5Щ f.2

1.1 1.0 О Л 0,8

0.1

0,6 0.5 ОЯ 0,Ъ 0.2. 0.1 О

0.2 0.# 6,6 6,8 1.0 нинотиноВоя ни слот а. мгм/

ft/I

5

0

концентрацию определяют, ич показаний оптической плоти -с-к (-Н154а; культуры и калибровочного графика.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Pseudomonas sp. ВКПМ В-3834 можно ны- являть и изучать продукцию никотиновой кислоты, начиная с 0,1 мкг/мл, на простых по составу минеральных средах среди различных групп микроорганизмов, в том числе ассимилирующие ни лпие спирты (этанол и метанол) качестве источников углерода и чноргии.

Формула и з о f p t т е н и

Штамм бактерий PseiHc is in ; sp BKiIM В-3834, испольтусмыи ; t г.-гг - тКУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОПр .1. J.-ЧМЯ ЧНКоТИП1,ьО

кислоты.