Способ определения мутагенной активности химических соединений Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к генетике, в частности к способам определения мутагенной активности химических соединений, и может быть использовано для прогноза генетических последст- ВИЙ загрязнения окружающей среды, для оценки потенциального мутагенного эффекта лекарственных веществ, для отбора высокоэффективных мутагенов, используемых а селекции, а так- же для оценки других видов биологической активности (например, бактерицидной, цитостатической, антимута- генной, радиозапщтной) химических соединений,

Цель изобретения - повышение эффективности и точности способа.

Пример 1, Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации in vitro иммобилизованной микросомаль- ной фракцией S-9 сразу после ее получения.

Микросомальную фракцию S-9 получают центрифугированием гомогената печени кур (9000 д., 60 мин).

3 г полиамидных гранул промьшают 300 мл дистиллированной воды при 60 С, инкубируют с 200 мл 3 М НС1 при той же температуре в течение 2 ч при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Гранулы отделяют фильтрованием, промьшают дистиллированной водой до рН 7,0 и инкубируют 20 ч с 200 мл J2, раствора глутарового альдегида при интенсивно перемешивании на магнитной мешалке. Активированный носитель отделяют фильтрованием, промывают дистиллированной водой До отсутствия запаха глутарового альдегида и 500 мл 0,02 М К НРО - КНРО -буфера; рН 7,2.

Отмытые гранулы рёсуспендируют в 35 мл того же буфера, вносят 5 мл препарата микросом с общим содержанием белка 45 мг, инкубируют 1ч при +4С и осторожном перемешивании. Вносят 16 мкл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида и инку- бируют 60 мин при той же температуре Гранулы отделяют фильтрованием, про- мьюают 0,02 М - КН РО -буфером, рН 7,2. По 10 мл 0,02 М КН РО -буфера (рН 7,2), содержащего 0,5-5 мг/мл циклофосфана, 3,4 мг/мл MgCl и 1,38 мг/нп НАДФ Н, объедини- ют с полученными гранулами, инкубируют в течение часа при постоянном встряхивании. Гранулы отделяют - раствора фи.пьтрованием через мембранный фильтр. Полученный фильтрат объединяют с бактериальной взвесью Salmonella tiphimuriiuns, штамм ТА 153 и вносят в чашки Петри, содержащие минимальную среду с добавлением агара до 1,5%, Чашки Петри помещают в термостат и инкубируют при 37°С в течение 48 чJ после чего подсчитьгаают количество колоний. Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 17- 19 раз.

Пример 2. Определение ty- тагенной активности циклофосфана после метаболической активации in vitro иммобилизованной фракцией S-100 сразу после ее получения.

Микросомальную фракцию печени кур получают центрифугированием(9000 д., 60 мин). Затем подвергают ее.центрифугированию (105000 д., 60 мин), су- пернатант отбрасывают, а осадок рёсуспендируют в 0,15 М растворе КС1.

Условия получения активированного носителя и иммобилизации препарата микросом идентичны описанным в примере 1, за исключением того, что все манипуляции производят при и н. иммобилизацию вносят 2 мл препарата микросом с общим содержанием белка 36 мг.

. По 10 мл раствора, содержащего 0,5-5 мг/мл циклофосфана, 2,84 мг/мл MgCl2 и 1,16 мг/мл НАДФ Н, объединяют с полученными гранулами, инкубируют в течение часа при непрерьшном встряхивании. Дальнейший ход определения идентичен описанному в примере 1,

Количество мутантов увеличивается по сравнению со спонтанным в зависимости от концентрации внесенного циклофосфана в 19-21 раз.

Пример 3. Определение мутагенной активности циклофосфана после метаболической активации ini vitro повторно используемым препаратом иммобилизованной фракции S-9, хранившейся с момента первого использования в течение 7 сут при (-4 С.

Условия получения препарата иммобилизованной фракции и тестирования активности идентичны описанным в примерах 1 и 2, за исключением того.

31258829 4

что препарат с момбнта получения и 7 сут. Чувствительность способа оп- первого использования до повторного ределения мутагенной активности сни- использования сохраняют ресуспенди- жается на 40%, но остается Достаточ- рованным в 0,02 М , - - ной для обнаружения мутагенной актив буфере, рН 7,2, при +4°С в -течение 5 мости циклофосфана.