Способ получения эндоглюканаз из ASPERGILLUS TERREUS ВКМ F-2220 Советский патент 1993 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/66 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментных препаратов для биоконверсии растительного сырья.

Целью изобретения является повышение выхода и упрощение процесса получения эндоглюканаз.

Сущность способа в том, что хроматографию проводят на карбоксильном катио- ните при рН 4,0-4,5 с последующей элюцией ферментов ацетатным буфером. рН 5,0-5.1 и 5,4-5,6.

Эндоглюканазы из подкисленного до рН 4,0-4,5 фильтрата культуральной жмдко- сти или раствора целлюлолитического комплекса в воде сорбируют на карбоксильном катирните; удаляют с сорбента целлобиазы промывкой исходным буфером, водой, 0,1 fyl ацетатным буфером рН 4,8; элюцию эндоглюканаз 1 и 2 проводят 0,2 М ацетатным буфером рН 5,0-5,1, Эндоглюканазы 3-0,3 М ацетатным буфером, рН 5,4-5,6.

Все используемые сорбенты являются полимеризационными карбоксильными ка- тионитами, содержащими в качестве кросс- агентй разные структуры, а именно дивинилбеизол или N,N -диметакроилапки- лекдиамии, или (о , со -диметйкроилэтилеи И полмэтиленгликояи, т.е. в предлагаемом способе могут быть использованы только карбоксильные катиониты - 11сиообмеиные . На карбоксильных катионитах на полисехаридной декстриновой оснозо типз СМ-С9фадекс зидоглюканазы Asp. terre-js ВКМ F-2220 при описанныхyc/iOBV flx не сорбируются.

Таким образом, эидоглюканазы получают Q одну стадию при хроматографии на карбоксильном катионите и суммарный выход эндоглюканаз при использовании способа составляет 100%. в то эремя как п прототипе 4%,

П р и м е р 1. Фильтрат культуральной жидкости или раствор комплекса гриба Азр, terreus ВКМ F-2220 в воде подкисляют до рН 4,0 и зндоглюканазы из него сорбируют на колонке с карбоксильным катионитом Биокарб Г-5 со скоростью 150 Р-ЧЛ/СМ -ч. Промывают исходным буфером {5 л/л сорбента), водой и затем 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,8, при зтом удаляется 90% целлобиазы. Элюцию зндоглюкаиаз 1 и 2 проводят 0,2 М 1зцетатным буфером, рН 5,0. Получают две эндоглюканазы с выходом

50,8 и 25,4% и степенью очистки 2000 и 2500. Эндоглюкаиазы 3 элюируютО,3 М ацетатным буфером рН 5,4. Получают зндоглюканазы 3 с выходом 23,8% и степенью

очистки 2000. В результате очистки из 30 л фильтрата культуральной жидкости получе- ноя :

зндоглюканаза - 765 спектрофотомет- рически.ч единиц белка с удельной активностью 41,3 ед/спектрофотометр. ед. белка;

зндоглюканаза 2-356 спектрофотомет- рических единиц белка с удельной активностью 44 ед/спектрофотометр, ед. белка; эндоглюканаза 3 - 400 спектрофотометрических единиц белка с удельной активностью 35.6 ед/спектрофотометр. ед. белка.

/ нaлoг чныe результаты по выходам эндоглюканаз t, 2м 3 получены при.использозании марок БиокарОов и ,

Биокар ов Э,

Пример 2, Эндоглюканазы гриба Asp. terreus ВКМ F-2220 получают хроматографией на карбоксильном кать-юните КМТ, как описано в примере 1, но фильтрат или раствор комплекса подкисляют до рН 4,5, злю- цию эмдоглюканаэ 1 и 2 гфооодят буфером с рН 5,1,. а эндоглюканазы 3 - буфером с рИ 5.6. Выход ферментов 100%,

П р и м а р 3, Зидоглюканазы гриба Азр.

terreus ВКМ F-2220 получаю-, как описано о гфимере 1, на колонке с карбоксильным катионитом КРК-1-2п, Выход фсрмснтоа 90%. 1 деитичиые результаты получены при про- оедении хроматографии на катиоиитах КРК1-5п, КРК-1-8П, КРК-Г-20П.

При м ер 4, Э I до г л ю к а н азы грнбэ Asp. tetteus ВКМ F-2220 получают, как. описано а примере 1, из колонке с карбоксильным катионитом КМ 2п, Выход ферментов 80%.

Использование способа позполит увеличить суммарный выход ферментов п 25 раз, снизить стоимость сорбеитоавдва раза и сократить время очистки аа счет увеличения скорости протока через колонку с сорбейтом.

(56) Hakansson U,, Fatiorstam Z., Blochlm Btophys Acca, 1978, 524, 385-392.

Ogawa F.,, Toyama H., Toyama M. J.Ferment Technol, 1982, 60, 3 9-356.

(Лаанова Г.С., Белецкая О.П., Окунев О.Н,, Голоолев Е.Л и Куг.аео И,С, Фракционирование целлюлззного комплекса гриба Asp. terreUsS. Прикладная биохимия и микробиология. 1983, т. 19, 362-368.

Формулаизобрет-ения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОГЛЮ- КАНАЗ ИЗ ASPERGILLUS TERREUS ВШ F-2220 путем хроматографии комплекса целлюлолитических ферментов, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса, хроматографию проводят не карбоксильном хатионите на

Редактор О.Юркова

Составитель Техред М.Моргентал

Заказ 3332

ТиражПодписное

НПО Поиск Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинатуТ1атент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

неполисахаридной основе, сорбцию осуществляют при рН 4,0 - 4,5 с последующей элюцией ферментов ацетатным буфером при рН 5,0 - 5,1 и 5,4 - 5,6. 5 2. Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве карбоксильного катионита используют катионит типа КМТ, или типа КРК, или типа Биокарб, или КМ.

Корректор Л.Филь