Питательная среда для выделения и отбора бактерий-продуцентов протеазы Советский патент 1986 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/125 

1 Изобретение относится к микробио логии и касается состава питательно среды для вьщеления, отбора и селек ции или индуцированного мутагенеза микроорганизмов - продуцентов проте аз. Цель изобретения - повьшение точ ности выделения и отбора продуценто протеазы. Изобретение осуществляется следу щим образом. Приготовление питательной среды, 20 г порошка сухого питательного агар-агара, выпускаемого Дагестанским научно-исследовательским институтом питательных сред, размешивают в 300 см воды и кипятят 5 мин при непрерывном перемешивании до полного растворения. 4 г сухого окрашенного казеина ОКА-АС растворяют в 100 см дистиллированной воды при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке. В 200 см подогретой до 70 С воды растворяют остальные компоненты питательной среды. После этого все компоненты перемешивают, корегируют рН до 6.8, доводят общий объем до 1000 см и автоклавирук1Т при 123 С в течение 30 мин. Далее среду охлаж дают до 50 С и разливают по 20 см в стерильные чашки Петри, Для прове ки на стерильность чашки со средой .ставят в термостат при 37 С на 24ч. За пределами указанных значений .компонентов питательная среда,не ок зывает ожидаемого э дакта. В табл,1 представлены средние ко личественные данные в пределах и за пределдми компонентов предлагаемой питательной среды. Для осуществления изобретения го товят питательные среды следуюш;его состава, г/дм воды. Среда 1. Агар-агар 15,0 Окрашенный казеин3,0 Глюкоза 0,3 Крахмал картофельныйрастворимый 6,0 Натрий азотнокислый1,0 Калий фосфорно-кислыйоднозамещенный 0,3 11 Калий хлористый 0,2 Магний серно-кислый 0,2 Железо -сернокислое 0,002 Среда 2 Агар-агар 25,0 Окрашенный казеин5,0 Глюкоза 2,0 Крахмал картофельный растворимый 20,0 Натрий азотнокислый3,0 Калий фосфорнокисльй однозамещенный 2,0 Калий хлористьш 0,8 Магний серно-кисльп 0,8 Железо сернокислое 0,04 Данные, представленные в таблИ, показывают, что за пределами соотношения компонентов полученные данные близки к данным оптимальной среды, поэтому нецелесообразно применение питательной среды с повьшенной концентрацией компонентов. При применении значений компонентов ниже предлагаемых полученные данные тоже немного отличаются от предлагаемой среды, однако выявляется тенденция к уменьшению зоны .гидролиза казеина, что ведет к неточности при отборе бактерий - продуцентов протеазы. Установлена прямая зависимость между соотношением величины зоны гидролиза казеина и диаметра колонии и протеолитической активностью, что отсутствует при использовании твердой питательной среды с неокрашенньм казеином. В табл.2 представлены результаты выращивания продуцентов протеазы на твердой среде с неокрашенным казеином и на жидкой среде. По-видимому казеин ОКА-АС необходим для биосинтеза протеазы, так как он стабилизирует рост клетки продуцентов. Пример. Для осуществления зобретения питательную среду готоят следующего состава, г/дм воды; Агар-агар 15,0 Окрашенный казеин 3,5 Глюкоза 0,5 Крахмал картофельный растворимьй 8,0 Натрий азотнокислый1,5 Калий фосфорно-кислыйодноз амещенный 0,5 Калий хлористый -0,3 Магний сернокислый0,3 Железо сернокислое 0,005 Выделение и отбор продуце теазы. Стерильные чашки Петри со засевают суспензией вегетати ток штамма Bacillus subtilis вергнутых воздействию нитро дина, и помещают в термостат на 36 ч. Варианты, прод щие протеазу, оценивают по в зон гидролиза казеина вокруг Зоны гидролиза казеина выраж ко, прозрачны на желтовато-о фоне. Измеряют диаметры колоний гидролиза казеина и вычисляю отношение. Выросшие варианты с разли личиной зон гидролиза казеин рильно микробиологической пе реносят в пробирки с ломтико феля, а потом засевают биоло пробирки диаметром 18-20 мм питательной средой следующег ва, г/дм воды: Крахмал картофельныйнерастворимый239,0 Кукурузный экстракт11,43 Пивные дрожжи2,19 Аммоний фосфорно-кисгшйдвузамещенный 8,40 Кальций хлористый0,45 Натрий хлористый0,29 Калий серно2,87 кисльй Магний серно0,14 кислый Медь серно0,0036 кислая Перед добавлением крахмала картофельного нерастворимого в среду производят его осахаривание. 239 г крахмала залийают 5GC см водопроводной воды, добавляют 150 мг амилосубтилина, нагревают до 70 С и выдерживают при постоянном перемешивании 20 мин, Раствор аммония фрсфорно-кислого стерилизуют отдельно при 120 С в течение 30 мин, В 200 см подогретой до 65.с воды растворяют остальные компоненты питательной среды. После зтого все компоненты.перемешивают, корегируют рН до 7,0, доводят общий объем до 1000 см и автоклавируют при в течение 30 мин. Выращивание проводят глубинным способом на качалке в течение 48 72 ч при З7с, Протеолитическую активность в культуральной жидкости определяют по ГОСТу 2026,4,2-74. Проверена протеолитиче.ская активность 50 вариантов с различным соотношением резмеров зоны гидролиза казеина и колонии (табл,3). Установлена прямая зависимость между соотношением размерюв зон гидролиза казеина и колоний и протеолитической активностью. В табл,3 даны результаты выращивания продуцентов протеазы иа твердой и жидкой средах. Полученные данные свидете11ьствуют о точности выделения и отбора бактерий - продуцентов протеазы на предлагаемой питательной среде, а также о наличии прямой зависимости между соотношением величины зоны гидролиза казеина и диаметра колониии протеолитической активностью. Таким образом, предлагаемая питаельная среда по сравнению с известой позволяет осуществить более глуокий гидролиз казеина, зоны гиддолиза выражаются четко и являются стабильными. Вариант среды ПротеолиОптимальные 11,5 значения Запредельные значения11 Коло- Размер Размер Соотно- Протеолит НИИ коло- зон гид- шение НИИ,мм ролиза зон гид- 1 казеи- ролиза пассаж на,мм с размером колоний, мм 6

4,8

3,2

1 2

15,5 4,9 17,3 3,5 2,4 19,3 8,0

3 4 5 6 7 8 9 3,9

7,1 1,8 5,6 4,2 23,4 6,6 27,1

J 3,2 6,2 20,0 2,8 14,0

5,0 2,0 10,2

5,1 4,2 3,4 1-4,2

0 И 6,2 12,3 2,0 тическая ак тивно ст ед/см 10,5 11,1 11,0

,4

10,3

10,0

10,0 8,5

8,2

8,3

8,0

8,2 7,9

8,1

10,0 0,3

10,4

11,0

9,4

97

9,0

6,3

6,4

6,5

6,0 0,4

10,7 10,0

10,1

12,5

12,3 3,9 12,9

14,9

15,6 15,1 5,0 15,8

16,7

15,5 6,0

12,5 2,0 12,9

12,7 Соотношение зоны , гидролиза с размеромколонии, мм 5 3,9 4,2 3,0 4 Таблица2 J еская активность, ед/см 2 3 4 ссаж пассаж пассаж

1263711

8 Яродолжение табл.2

10

1263711 Продолжение табл.2

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И рТБОРА БАКТЕРЮ - ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕАЗЫ, включающая источник казеина, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения точности выделения и отбора продуцентов, в качестве источника (сазеина она содержит окрашенный казеин ОКА-АС и дополнительно глюкозу. крахмал картофельный растворимый,натрий азотно-кислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий хлористый, магний серно-кислый и железо серно-кислое при следуннцем содержании компонентов,г/дм : Окрашенный казеин ОКА-АС 3,5-4,5 Глюкоза0,5-1,5 Крахмал картофельный раст8,0-15,0 воримый Натрий 1,5-2,5 азотно-кислый Калий фосфор- . j 0,5-1,5 но-кислый (Л однозамещенный 0,3-0,6 Калий хлористый Магний серно0,3-0,6 кислый Железо серно0,005-0,02 кислое 15,0-25,0 Агар-агар fc Остальное Вода Э5 :о

4,5

18

4,0 6./5 13 10

2,0 3,3

3,0

Таблица 3

12,94 13,1012,89 13,20

15,05 15,0015,00 14,93

10,40 10,5810,15 10,ч7

11

12

126371 /Продолжение табл.3

i3

126371 I

14 Продолжение табл.З