2- -Бензоил амидогептиламино-4-окси -триазинилагароза,как сорбент для гидрофобной хроматографии гликозидаз Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

где- R- (СНо)мСН.,-(СН2)пСбН5,-С.П5; n .1- 10,

которые получают посредством конденсации алифатических или ароматических аминов с .бромциан-активированной агарозой 1. где R-(СК2)и CHj.-CgHs; n 5, 6, 7, которые получают эпоксидированием агарозных алифатическими или ароматическими эпоксидами 2. Эти сорбе где R-(СН2)п.МНСОСНз, n 4,7 -(CH2),NMCOCgH5, п 4, получаемых посредством конденсации MOHo-N-ацилалкилдиаминов с агарозой активированной трихлортриазином 3 Содержание моно-Ы-ацилалкилдиаминов в таких сорбентах 7-12 мкмоль на 1 мл сорбента. Однако перечисленные гидрофобные сорбенты обладают рядом существенных недостатков. Во-первых,/активация сефарозы 4Б бромцианом приводит к получению сорбента с ярко выраженными ионо. обменными свойствами (рксхЮ для Ы-ацилзамещенной имидокарбаматной группы), сильно ослабляющими процесс гидрофобной хроматографии фер ментов. Кроме того, ковалентная связь между алифатическими или аро матическими- аминами и бромциан-ак.тивированной агарозой является лабильной в присутствии сильных .. нук/1еофилов, Что в значительной ст пени затрудняет проведение хромато графии и регенерацию сорбента в нукл-еофильных буферных системах. во-вторых, эти сорбенты не явля ются избирательными гидрофобными {сорбентами гликозидаз,так как небо шая длина их углеводородных боковы цепей недостаточна дляспецифического гидрофобного взаимодействия с этими ферментами. В-третьих,.вре меннообразующиеся мицеллоподобные . комплексы между этими сорбентами и гликозидазами характеризуются ни кой константой связывания, сильно зависящей от ионной силы, рН и при роды используемых буферов, что неПолученные производные содержат 10-20 мкмоль алкил- или ариламина на 1 мл сорбента.

Для целей гидрофобной хроматографии используют также ряд других соединений общей формулы К 25-150 ты содержат 40 мкмоль алкильных и арильных групп на 1 мл сорбента. Известен также ряд соединений общей формулы ..а-к J 25-i50 довлетворительно отражается на прочности сорбции гликозидаз и их элюции в процессе хроматографии. В-четвертых, эти сорбенты, наряу с гликозидаз.ами, связывают значительное количество других белков и ферментов, что не позволяет осуществить выделение и. очистку глико- . зидаз непосредственно из биологических экстрактов. Цель изобретения - синтез нового сорбента, устраняющего указанные недостатки ранее описанных сорбентов . Указанная цель достигается за счет того, что в качестве сорбента используют новое производное агарозы - 2-Ы-бензоиламидогептиламино-4окси-Зут-триазинилагарозу общей формулы 1. Этот сорбент является избирательным гидрофобным хроматографическим сорбентом для выделения, иммобилизации, концентрирования и очистки гликозидаз, в частности N-ацетил- р-О-гексозаминидазы(К. Ф. 3.2. 1.52) и р-галактозидазы (К. Ф. 3. 2.1. 23). Он может быть использован в биохимическом производстве. Согласно изобретению описывается химическое соединение, производное агарозы-2-Ы-бензоиламидогептиламино--4-окси-8ут-триазинилагароза указанной обцеи формулы I в качестве сорбента для гидрофобной хроматографии гликозидаз. , . 2-Ы-Бензоиламидогептиламино-4-окси-Зуто-триазинилагарозу получают способом аналогом -четырехстадийным синтезом: 1) активаций агарозы трихлортриазином, 2) замещение атома хлора в 2,4-Дихлор-5ут-триазинигага розе гептаметнлендиамииом, 3) гидролиз хлора 2-аминогептиламино-4-хлор -Sym-триазинилагарозы и 4) N-бензоилирование полученного соединения. Активацию агарозы трихлортриазином проводят в слабо щелочной среде при рН 8,,5 для достижения .1аксимальнои скорости активации и для связывания образующейся в реакции хлористоводородной кислоты. Заме1 1ени одного из атомов хлора гептаметилен диамином в трихлортриазин-активиров ной агарозе осуществляют обработкой 2 ,4-дихлор-8ут- триазинилагарозы раст вором соответствующего диамина в 0,7 М бикарбонатном буфере рН 8,3-9 При этом значении рН достигается ма симальное включение гептаметилеидиамина в агарозный гель. Замещение ато ма хлора jD 2-аминогептиламино-4-хлор -5ут-триазини 1агарозе на гидроксил проводят последующим; гидролизом этого соединения в 0,5 М карбонатном буфере рН 10,0 - 10,5 при 20°С в течение 30 мин. Бензоилирование 2-ам)1ногептиламино-4 окси-Sym -триазинилагарозы бензойк эй кислотой осуществл ют в водно-диоксановом растворе в присутствии дициклогексилкарбодиимида. . Таким образом, введение в агарозный гель гидрофобной молекулы N-бензоиламидогептиламина резко меняет гидрофильность этого полимера и способствует обратимому образованию мицеллоподобных комплексов между выделяемыми ферментами и гидрофобными участками геля. Применяя условия, необходимые для .диссоциации таких комплексов, получают нативные ферменты. 2-N-Бeнзoилaмидoгeптилaминo-4-окси-5ут-триазинилагароза проявляет свойства избирательно сорбировать гликозидазы и может быть исполь зована для выделения, иммобилизации концентрирования и очистки этих ферментов. Ниже приведен пример получения 2-Н-бензоиламидогептиламино-4-окси-Sym-триазинилагарозы. Пример. 1 стадия: 2,4-дихлор-Зут-триазинилагароза. К суспензии 25 мл сефарозы 4Б (Pharmacia Fine Chemica8s, Sweden) в .20 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании и охлаждении (3 1°С) прибавляют 1 г (5,4 ммоль) трихлортриазина в 25 мл ацетона, доводят рН смеси до 8,5 0,5 1 М раствором едкого натра и поддерх.ивают это значение рН в течение 3-10 мин. Об окончании активациисвидетельствует резкое изменение рН реакционной среды в щелочную область (выше 9,0) от прибавления небольшого избытка 1 М раствора едкого натра. Суспензию быстро выливают в равный объем холодной 25%-ной уксусной кислоты, фильтруют и промывают на фильттре охлажденным 50%-ным водным ацетоном (100 мл) и дистиллированной водой (300 мл). Аликвоту полученного геля вь с т11ивают в вакууме над до постоянного веса и анализируют. Найдено, %: С 44,21; Н 5,02; N 1,76, С€2,08, что соответствует замещению каждого 9-15 остатков галактозы в агарозе. 2стадия: 2-аминогептиламино-4-хлор-Зут-триазинилагароза, К раствору 2 г (15 ммоль) гептаметилендиамина в 20 мл 0,7 М раствора бикарбоната натрия (рН 8,8-9,0) прибавляют 25 мл 2,4-дихлор-5у1п-триазинилагарозы. Смесь интенсивно перемешивают в течение 1 ч при 18°С. Сефарозу отфильтровывают и прол1ывают дистиллированной водой до отрицательной реакции фильтрата с нингидрином. Найдено: 1 мл геля содержит 1020 мкмоль гептаметилендиамина. 3стадия: 2-аминогептиламино-4-окси-Зут-триазинилагароза. Гидролиз 2-аминогептиламино-4-хлор-Sym-триазинилагарозы проводят 0,5 М раствором карбоната натрия (рН 10,0 10,5) в течение 30 мин при 20°С. Найдено: отсутствие хлора. 4стадия: 2-N-бензоиламидогептиламино-4-окси-Зут-триазинилагароэа. К раствору 0,25 г (2 ммоль) бензойной кислоты в 2 мл метанола прибавляют 25 мл 2-аминогептиламино-4-окси-Зрт-триазинилагарозы в 40 мл водного диоксана (диоксан: вода 2:3) и 0,8 г (4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 12 ч при 18°С, сорбент отфильтровывают и промывают 50%-ным водным метанолом (300 мл), 50%-ным водным ацетоном (100 мл) до отрицательного содержания в полученном геле дициклох ексилмочевины и затем дистиллированной водой (300 мл). Получают 25 мл.2-N-бен зоиламидогептиламино-4-окси-Буга-триазинилагарозы.Методом титрования с тринитробензолсульфокислотой в геле не обнару) свободных аминогрупп. Формула изобретения 2-N- Бензоиламидогептиламино-4-окси-5ут-триазинилагароза формулы NH-R ч / )r О ,ьо с -0 О |«Н5 М y Н,Т -f 25-150 . Л- .- 660 «... где R-{CHg) NHCOCgH-j как сорбент для гидрофобной уроматографин гликозидаэ. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l,Er-ee Z-fZaidentaig-3.,S1iaetieeS-,HvdlOcxDirbon-coated Sepharoses-Use inttie puviiication of g-eijcog-enphosf ory&ose Biocli Bioptiys Res.Coromun. 1972,49,P-382.. 9758 2,Hjerten S .Rosen ren a.,Pctbeman S.,H 3roptiobic interaction chromaiograpliy.Tlie SvnlViesis and t1ie use of some пеЬЕ and ап& derivatives of agfarose-H-of diromoto raph, 1974, 101, p. 281-288. g a. A-,Mo odtsov N-.Hvidiopbobic chroiriatogrrapVi of N-acet)E.-p -D-1iexosaminidase..of Chromatograpliv, 1977, 130, p. 451-453.