Способ определения пероксидазы Советский патент 1987 года по МПК G01N33/58 

112

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промьшшенностях, например, для определения ферментативной активности ген-содержащих веществ и биологических препаратов.

Цель изобретения - упрощение способа определения пероксидазы.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят различные концентрации пероксидазы на постоянном фоне перекиси водорода в натрий-ацетатном буфере рН 3,8. На смоченную дистиллированной водой или буфером эмульсионную поверхность иодид серебряной фотопластинки в темноте с по- мощью автоматического микродозатора наносят пероксидазосодержащие растворы. Через определенный йромежуток времени в зависимости от ожидаемой концентрации пероксидазы фотопластинку проявляют, закрепляют, сушат. Количественную оценку пероксидазы осуществляют путем микрофотометриро- вания пятен на фотопластинке .и сопоставления данных с градуированным гра фиком.

Пример 1. Для построения гра- дуировочного графика для определения пероксидазы на эмульсионную поверхность фотопластинки IIford Q с помощью автоматической микропипетки наносят по 50 мкл пероксидазосодержа- щих растворов, полученных путем последовательного разведения исходйого раствора пероксидазы хрена (RZ 0,6 Reanal) на фоне 0,1 М натрий ацетатного буфера (рН 3,8), содержащим 1 мМоль перекиси водорода. Диапазон

определяемых содержаний иероксидазы ферментного анализа с использованием

вторых антител) растворяют в физиологическом растворе. Концентрацию белка определяют на спектрометре с использованием номограмм при 260 нм и 280 нм. Концентрацию пероксидазы рассчитывают по формуле С 0,44 мг/мл при Л 403 нм. Полученные растворы разбавляют 0,001 М раствором Hj Oj , приготовленным в 0,1 М

(шкапа) содержит 0,01 - 10,0 кг/мп пероксидазы.

Пластину оставляют в темноте на 10 ч. Затем, стряхнув капли раствора, ее проявляют. Полученные на месте контактирования с пероксидазосодер- жгицим раствором пятна фотометрируют на микрофотометре МФ-4, используя шкалу почернений. Строят градуировоч- ньй график IgC

SO

в координатах 5 натрий-ацетатном буфере рН 3,8. Раз- „ероксмАо ы почернение. Коэф-ведения проводят в лунках полистирофициент вариации определения не бо-ловых микроплат для проведеИия иммулее 10%. Результаты определения пер-( нологических реакций, получая по 12 оксидазы приведены в табл.1.разведений (максимальное - в 2048

Таблица 1

0

П р и м е р 2. Несколько кристалликов лиофилизированного иммунопер- оксидазного конъюгата для иммунофер- ментного анализа: аспарагиназа - liep- оксидаза н иммуноглобулин G осла против иммуноглобулина G кролика меченый пероксидазой (соответственно конъюгат для прямого конкурентного иммуноферментного анализа н иммунораз), В соседний ряд лунок залива- нл- стандартные концентрации нативной пероксидазы. Производят оценку годности конъюгатов, сравнивая его активность с активностью нативной пероксидазы . по эффекту на фотопластинках. Результаты определения пероксидазы в конъюгатах для иммунофермент- ного анализа представлены в табл.2.

Конъюгат аспара- гиназа-пероксйФормула изобретения Способ определения пероксидазы путем проведения ферментативного окис- О Ленин иоди дов перекисью водорода с последующим учетом полученных результатов, отличающийся тем, что с целью упрощения способа, ферРедактор А.Сабо

Составитель Е.Воробьева Техред И.Попович

Заказ 7638/46 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

В че.тырех образцах конъюгат имеет удовлетворительную активность, в одном - неудовлетворительную (12%) и не может быть использован в иммуно- ферментном анализе.

Таким образом, не уступая извег.т- ным способам по показателям чувствительности и точности, предлагаемый

является способом более простым.

I

Таблица 2

ментативное окисление , проводят на фотоматериале, содержащем йодистое серебро, а концентрацию пероксидазы определяют по интенсивности засветки используемого фотоматериала после его проявления при сопоставлении с градуировочным графиком.

Корректор М.Самборская

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой, фармацевтической промьшшенности. Для количественного определения пероксидазы готовят разведения анализируемого раствора, содержащего пероксидазу путем добавления раствора перекиси водорода в натрий-ацетатном буфере. С помощью микродозатора разведения наносят на поверхность иодид серебряной фотопластинки в темноте. После инкубирования фотопластинку проявляют, закрепляют, сушат. Колнчественную оценку пероксидазы осуществляют путем микрофотометрирования пятен на фотопластинке и сопоставления данных с калибровочной кривой. Изобретение позволяет упростить определение пероксидазы при сохранении чувствительности и точности анализа. 2 табл. S Ю 00 СП 00 |