Способ количественного определения белковых фракций в крови животных Советский патент 1987 года по МПК G01N33/68 

JO

15

11307338

Изобретение относится к биохимии, в частности к выявлению белковых фракций на крахмальном геле после их разделения методом электрофореза.

Цель изобретения повышение точности определения белка во фракциях.

Способ заключается в том, что в качестве красителя используют водорастворимый нигрозин в количестве, составляющем 0,003 мас.%. Количество водорастворимого нигрозина установлено опытным путем, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2-3 мас,%.

Способ определения белковых фракций на крахмальном геле осуществляют следующим образом.

Пример 1. Готовят растворяющую и отмывающую смесь. Для этого берут метанола 300 мл, воды 600 мл, ледяной уксусной кислоты 100 мл. В 100 мл указанной смеси растворяют 20 мг нигрозина водорастворимого. В краситель помещают крахмальную элект- рофореграмму сыворотки кролика на 20 мин, после чего указанную форе- грамму выдерживают по 60-90 нин в трех последовательных порциях приготовленной отмывающей смеси. Аналогичную (параллельную) электрофореграмму окрашивают амидочерным 10Б и отмывают в смеси метанол-вода-ледяная уксусная кислота в соотношении 5:5:1, так как краситель амидочерный 10Б требует большого количества метанола.

Результаты количественного определения содержания белковых фракций сыворотки крови кролика на крахмальных фореграммах (одна фореграмма окрашена амидочерным 10Б, вторая - нигрозином, водорастворимым), промытые указанными отмьгоающими смесями, приведены в табл.1.

Пример

ряющей и отмываюш,ей смеси применяют следующий состав: метилового спирта

Количественное содержание белковых фракций сыворотки крови бычка № 1, окрашенных амидочерным 10Б и водорастворимым нигрозином, по данным электрофореза в крахмальном геле представлено в табл.2.

Пример 3. Для приготовления красителя берут 25 мг водорастворимого нигрозина на 100 мл смеси следующего состава: метанола 250 мл, воды 625 мл, ледяной уксусной кислоты 125 мл. Окрашивают и отмывают электрофореграмму сыворотки крови бычка № 2 на крахмальном геле аналогично примеру 1. Параллельная электрофоре- грамма того же бычка окрашена амидочерным 10Б.

Результаты количественного определения белковых фракций сыворотки крови бычка № 2 представлены в табл.3

Как видно из .полученных примеров табл.1-3, краситель нигрозин водорастворимый адсорбируется равномерно всеми сывороточными белками. Особенно четко это видно в альбуминовой фракции всех животных. Количество связанного этой фракцией нигрозина водорастворимого пропорционально количеству белка на крахмальной форег- рамме. Краска избирательно окрашивает белковые вещества. Допускаем слабое окрашивание крахмального геля, которое не мешает ясности границ раздела между фракциями белка на крах- 35 мальной фореграмме. Указанная отмывающая смесь обеспечивает хорошее отмывание красителя, четкость окраски

20

25

30

40

и экономит расход метанола почти в два раза.

Таким образом, предлагаемый способ повышает точность определения белковых фракций, так как краска избирательно окрашивает их, слабо окрашивается крахмальный гель и ясно Z. В качестве оаство-./):

выделяются границы раздела между фракциями белка на крахмальной фореграмме. Использование предлагаемого способа в практике способствует точности определения белка в каждой фракции и экономит метанол - дорогостоящий и дефицитный материал (так как на 100 фореграмм расходуется метанола на 20 л меньше).

200 мл, воды 650 мл, уксусной кислоты 150 мл. Для красителя берут 30 мг водорастворимого нигрозина в 100 мл смеси. В указанный краситель помещают электрофореграмму сыворотки крови бычка № 1 на крахмальном геле на 25 мин с последующим отмыванием кра

сителя в указанной смеси в течение трех раз по 60-90 мин.

Параллельную электрофореграмму окрашивают амидочерным 10Б анапогич- но примеру 1.

50

55

Формула изобретения

Способ количественного определения белковых фракций в крови животных.

5

Количественное содержание белковых фракций сыворотки крови бычка № 1, окрашенных амидочерным 10Б и водорастворимым нигрозином, по данным электрофореза в крахмальном геле представлено в табл.2.

Пример 3. Для приготовления красителя берут 25 мг водорастворимого нигрозина на 100 мл смеси следующего состава: метанола 250 мл, воды 625 мл, ледяной уксусной кислоты 125 мл. Окрашивают и отмывают электрофореграмму сыворотки крови бычка № 2 на крахмальном геле аналогично примеру 1. Параллельная электрофоре- грамма того же бычка окрашена амидочерным 10Б.

Результаты количественного определения белковых фракций сыворотки крови бычка № 2 представлены в табл.3

Как видно из .полученных примеров табл.1-3, краситель нигрозин водорастворимый адсорбируется равномерно всеми сывороточными белками. Особенно четко это видно в альбуминовой фракции всех животных. Количество связанного этой фракцией нигрозина водорастворимого пропорционально количеству белка на крахмальной форег- рамме. Краска избирательно окрашивает белковые вещества. Допускаем слабое окрашивание крахмального геля, которое не мешает ясности границ раздела между фракциями белка на крах- 5 мальной фореграмме. Указанная отмывающая смесь обеспечивает хорошее отмывание красителя, четкость окраски

0

5

0

55

Формула изобретения

Способ количественного определения белковых фракций в крови животных.

313073384

предусматривающий электрофоретичес-учетом результатов, отличаю- кое разделение белков на крахмальномщ и и с я тем, что, с целью повышателе, окрашивание электрофореграмм,ния точности определения, в качестве отмывку их смесью, состоящей из мета- .красителя используют водорастворимый нола, уксусной кислоты и воды, элюи- 5нигрозин в количестве, составляющем рование связавшегося с белком краси-0,003 мас.%, а количество метанола теля и определение экстинкции злюи-в смеси для отмывки устанавливают

рованного красителя с последующим равным 2-3 мас.%. I

Таблица 1

Примечание. Содержание общего белка 6,47 г%.

Предальбумин 0,02 1,2 0,1 0,02 1,3 0,11 Альбумин 0,42 26,0 2,1 0,48 32,8 2,65

Таблица 3

Примечание. Содержание общего белка в сыворотке крови бычка

8,09 г%.

Редактор С.Лисина

Составитель Л.Борисова Техред Л.Олейник

Заказ 1625/43Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Продолжение табл.3

Корректор С.Шекмар

Изобретение относится к области биохимии, к выявлению белковых фракций на крахмальном геле после их разделения методом электрофореза. Целью изобретения является повьшение точности определения белка во фракциях. Способ заключается в использовании красителя - водорастворимого нигрозина для окрашивания электрофореграмм в количестве, составляющем 0,003 мае.%, а количество метанола в смеси для отмывки устанавливают равным 2-3 мас.%. Использование в качестве красителя водорастворимого нигрозина повышает точность определения белковых фракций, а также требует в два раза меньше метанола для отмывки крахмальных фореграмм. 3 табл.