Способ очистки синтетических [8-аргинин]вазопрессина или окситоцина Советский патент 1992 года по МПК C07K7/16 C07K1/14 

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно способам очистки синтетических коротких пептидных гормонов-нонапептидов 8-аргинин вазоп- рессина или окситоцина, используемых в медицине и ветеринарии.

Основными фармакологическими свойствами 8-аргинин вазопрессина являются регуляция водно-солевого обмена и антидиуретическая активность у позвоночных, повышение кровяного давления у млекопитающих. Окситоцин обладает способностью к сокращению гладкой мускулатуры матки у млекопитающих и усилению лактации.

Синтетические 8-аргинин вазопрессин или окситоцин, полученные как твердофазным, так и классическим методом в растворе обычно содержат балластные вещества в виде солей, а также примеси пептидов, образуемые как побочные продукты синтеза. Однако для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты 8-аргинин вазопрессина и оксито- цина. Обычно очистка 8-аргинин вазопрес- сина или окситоцина осуществляется в несколько стадий. На первой стадии - обес- соливания - происходит отделение от солей и лишь в небольшой степени от примесей пептидной природы, на второй и последующих стадиях - от пептидов, загрязняющих целевой продукт и значительно снижающих биологическую активность пептидного гор- мона.

Для очистки синтетических 8-арги- нин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы известно использование противоточного распреде- ления, заключающегося в многократном распределении вещества между двумя жидкими фазами.

Недостатком данного метода является необходимость использования дорогостоя- щего оборудования и сложность технологического процесса. Достичь существенной очистки и высокого уровня биологической активности можно только при значительном количестве переносов, а именно, для 8-ар- гинин вазопрессина - 198, (а для окситоцина - 300. При этом используются значительные объемы органических растворителей.

Известен также способ очистки синте- тического окситоцина путем распределительной хроматографии на сефадексе G-25, который осуществляется при элюировании веществ на хроматографической колонке смесью растворителей

Недостатком данного способа является то, что воспроизводимые и удовлетворительные результаты очистки получены лишь при использовании многокомпонентной смеси бензола, бутанола, пиридина, уксус- ной кислоты и воды. Кроме того, четырехста- дийная подготовка носителя к работе приводит к длительному (5-6 дней) циклу о°истки и требует значительных объемов растворителей. Вследствие образования двухфазной системы на хроматографической колонке необходимо использовать избыточное давление, а колонку периодически перебивать для предотвращения высокого сопротивления носителя.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки синтетических 8- аргинин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы гель-фильт- рацией на колонке с сефадексом G-15 при элюировании 0,2 н.уксусной кислотой. Подготовка к работе и регенерирование сефа- декса осуществляется длительное время 50%-ной уксусной кислотой

Однако такая обработка декстрановых носителей, в частности сефадексов, нежелательна из-за их ограниченной устойчивости в сильнокислой среде. В этих условиях происходит химическая деструкция сефадекса, его частичное растворение и загрязнение продукта. Кроме того, хранение сефадекса в рабочем состоянии в водном растворе невозможно вследствие легкости разложения его микроорганизмами, а использование антисептика или хранение при пониженной температуре требует дополнительных материальных и энергетических затрат. Сефа- дексы обладают ограниченной механической прочностью, что ограничивает применение избыточного давления. Этот фактор, а также значительная длина колонки, например, для очистки окситоцина длина колонки составляет 110см, «нественно снижают технологичность процесса.

Цель изобретения - упрощение процесса очистки синтетических пептидных гормонов 8-аргинин вазопрессина или окситоцина от примесей пептидной природы.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве носителя предлагается использовать гидрофильный полимер на основе 1- винил-2-пирролидона со свойствами, позволяющими преодолеть недостатки сефадекса, т е. повысить устойчивость к кислым средам

Сополимеры 1-винил-2-пирролидона с N,N -метиленбисакриламидом, а также модификации этого полимера различными N- замещенными низшими алкилами метакриламидами используют для гель- фильтрации белков. Однако они не применяются для очистки олигопептидов.

Согласно предлагаемому способу для очистки нонапептидных гормонов 8-арги- нин аазопрессина или окситоцина гель- фильтрацией используется в качестве носителя сополимер 1-винил-2-пирролидо- на с N.N -диметакроилгексаметилендиами- иом формулы

сн,

пз

{снгсн снгс- -к

,Мч .

КН2)6 NH

9

СН:

где I 0,92-0,94 k 0,06-0.08, диаметр набухших гранул полимера 0,05- 0,125 мм. Элюирование проводят 0,2 н.уксусной кислотой, регенерирование носителя - 50%-ной уксусной кислотой. Данный способ позволяет осуществить очистку 8-аргинин вазопрессина или оксито- цина от примесей пептидной природы по стандартному циклу, приведенному в табл. 1.

Рабочая хроматографическая колонка находилась в 0,2 н.уксусной кислоте в течение двух лет. За это время на ней успешно проведено 12 делений 8-аргинин вазопрес- сина и окситоцинэ практически без измене- ний структуры носителя, условий и результатов очистки, с хорошей воспроизводимостью результатов.

Предлагаемый полимер не подвергается разрушению микроорганизмами в вод- ной среде при комнатной температуре, не требуя дополнительных материальных и энергетических затрат, связанных с использованием антисептика или хранением при пониженной температуре. Не наблюдается его химическая деструкция в сильнокислой среде и связанное с этим загрязнение продукта, что позволяет применять многократно регенерацию 50%-ной уксусной кислотой. Полимеры на основе 1-винил-2- пирролидона обладают более высокой механической прочностью по сравнению с сефадексами, при использовании избыточного давления не происходит механической деструкции полимера. Согласно предлагав- мому способу применяется колонка длиной в 28,5-47,5 см, что повышает технологичность метода.

Исходные вещества 8-аргинин вазоп- рессин и окситоцин синтезировали класси- ческим методом в растворе. Отщепление бензильной защиты сульфгидрильной группы цистеина в обоих случаях осуществляли натрием в жидком аммиаке. На этой стадии из-за жесткого воздействия образуется зна- читальное количество примесей в результате разрушения пептидных гормонов. Для образования дисульфидной связи 8-арг и- нин вазопрёсдина использовали феррициа- нид калия, циклизацию окситоцина осуществляли Й202. Большую часть примесей, образующихся на этой стадии в результате межмолекулярного окисления составляют изомерные димеры. Полученные 8-аргинин вазопресссин или оксито- цин обессоливали на амберлите IRC-50 (Н4) лиофилизовали и использовали для очистки по предлагаемому способу. В качестве исходного использовали также загрязненный окситоцин, представляющий собой узкую

фракцию с пониженным содержанием целевого гормона после очистки окситоцина для ветеринарии препаративной 8ЭЖХ на но- ситиге Силасорб Cie. Характеристики исходных и очищенных по предлагаемому способу продуктов приведеныв табл. 2.

Известно, что вазопрессорная активность очищенного 8-аргинин вазопрессина составляет470+20 МЕ/мг, очищенный окситоцин обладает биологической активностью 480 МЕ/мг. В соответствии с табл.2 пониженная биологическая активность для 8-ар- гинин вазопрессина составляет -22°,для окситоцина-25,5°-значениеугла удельного вращения связано с невысоким содержанием целевого пептида в исходных образцах. В результате очистки по предлагаемому способу наблюдается улучшение физико-химических характеристик продуктов и получают практически индивидуальные по ВЭЖХ продукты с биологической активностью, аналогичной прототипу.

Индивидуальность веществ контролировали тонкослойной хроматографией на пластинах Силуфол в системах (соотношения объемные):

1)н-пропанол - вода, 25%-ный аммиак 6:1:3:

2)н-бутанол - пиридин-уксусная кислота-вода 15:10:3:12;

3)н-бутанол - уксусная кислота-вода 3:1:1;

4)пиридин - уксусная кислота - вода 50:30:15;- -

5)н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:5 (верхняя фаза);

6)н-бутанол - уксусная кислота - вода 4:1:1,

ВЭЖХ на колонке Servachrorrt Si:100:Polyol:RP8 (250x4,6 мм), размер частиц 5 мкм, элюент 0,05%-ная трифторуксус- ная кислота, градиент ацетонитрила от 15 до 30% и на колонке Ultrasphere Octyl (250x4,6 мм) элюент 0,05 М КНзРОз, градиент ацетонитрила от 10 до 60%, детектирование проводили при длине волны 226 нм. Величины углов удельного вращения определялись на поляриметре Perkln - Elmer 241 me.

Пример 1. Очистка 8-аргинин вазоп- рессина.

Раствор 90 г 8-аргинин вазопрессина с вазопрессорной биологической активностью 324 МЕ/мг, в 0,8 мл 0,2 н.уксусной кислоты наносят на колонку 16x47CMC сопо-. лимером 1-винил-2-пирролидона с N.Nl -ди- метакроилгексаметилендиамином с I 0,94, k 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05- 0,07 мм и элюируют со скоростью 9,5 мл/ч. Отбирают55 мл элюата и фракционируют по 1 мл. Фракции, содержащие целевое вещество, объединяют и лиофилизуют. Получают 57,3 мг (91% по основному веществу) 8-аргинин вазопрессина, индивидуального по ТСХ в Системах 1-4.

Пример 2. Очистка окситоцина.

Раствор 109 мг окситоцина в 1 мл 0,2 н.уксусной кислоты наносят на колонку 1,6x43.5 см с сополимером 1-винил-2-пир- ролидона с М,м -диметакроилгексаметилен- диамином с I 0,94, к 0,06 и диаметром набухших гранул 0,05-0,07 мм и элюируют со скоростью 6 мл/ч. Собирают 40 мл элюа- та, фракционируют по 1 мл. Фракции, содержащие целевое вещество, объединяют и лиофилизуют, Получают 33,3 мг (64 %) по основному веществу) окситоцина, индивидуального по ТСХ в системах 5 и 6.

Пример 3. Очистка загрязненного окситоцина.

Желтоватый раствор 103 мг окситоцина с биологической активностью 99 МЕ/мг наносят на колонку 1,6x28,5 см с сополимером 1-винил-2-пирролидона с N,N-диметакро- илгексаметилендиамином с I 0,92, k 0,08 и диаметром набухших гранул 0,1-0,125 мм и элюируют аналогично примеру 2. Получают 10,4 мг (51% по основному веществу) окситоцина.

Пример 4. Получение сополимера 1-винил-2-пирролидона с N ,N-диметакро- илгексаметилендиамином.

В 1,5 л деминерализованной воды растворяют 115 г хлорида натрия при 95°С и перемешивании, добавляют суспензию 40 г крахмала в 100 мл деминерализованной воды, кипятят в течение 5-10 мин, охлаждают до 40°С и растворяют в реакционной среде 180 г карбоната калия. При перемешивании в течение 3-5 мин добавляют раствор моно- меров, состоящий из 150 мг 1- винил-2-пиррол и донаи

М,м -диметакроилгексаметилен- диамина (21,7 г для k 0,06 и 29,6 г для k 0,08) 150 мл циклогексанола и 1,5 г азоСтандартныйвазопрессина

бис-шобу.иронитрила . Реакционную массу перемешивают при 55иС 20 мин и повышают температуру до 70°С в течение 2 ч. Сополи- меризацию продолжают 3 ч, завершая ее

при 80°С. Реакционную массу охлаждают и разбавляют 5 л деминерализованной воды. Полученные гранулы несколько раз промывают этанолом или пропанолом и фракционируют на ситах с различными размерами

ячеек. Получают фракции сополимера 1-ви-. нил-2-пирролидона с N.N -диметакроилгек- саметилендиамином с I- 0,94 и k 0,06 или I 0,92 и k - 0,08 и диаметром набухших гранул от 0,05 до 0,315 мм с общим выходом

81 %. Удельный объем гранул в воде 5,8-6,2 мг/л. Фракции с диаметром набухших гранул 0,05-0,125 используют для очистки. Формула изобретения Способ очистки синтетических 8-аргинин вазопрессина или окситоцина гель- фильтрацией на колонке при элюировании раствором уксусной кислоты,отл ичающ- и и с я тем, что с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют сополимер 1-винил-2-пирролидона с N.N-диметакроилгексаметилендиамином формулы-„

М- ;нНснг Нк

.

NH

о351СН2)б

МН

(0 40-Н2С-С

СН3

где I 0,92-0.94; k - 0,06-0,08,

с диаметром набухших гранул 50-125

45

цикл очистки 8-аргинин или окситоцина

Т а бл и ц

Характеристика исходных и очищенных продуктов

Тавлиц« 2

Изобретение относится к медицине и ветеринарии. Сущность изобретения состоит в очистке на колонке при использовании в качестве носителя сополимера 1-винил-2- пирролидона с N.N-диметакроилгексамети- лендиамином {Шг-сн сн с Нз)--N4 с оснъ ° NH(cH2)6NHCo-c-- сн2-сн2Јн сн I 2 где I 0.92-0,94; k 0,06-0,08, диаметр набухших гранул 50-125 мк. Цель - упрощение процесса очистки, увеличение срока службы носителя. Рабочая колонна находилась в 0,2 н. СНзСООИ 2 года, проведено 12 очисток без изменения структуры носителя. 2 табл. %1 VJ СЛ

Чистоту (8-аргининЗ вазолряссина исследовали в системе н-проланол - вода - анниак 6:1:3, окситоцин - в систем

н-бутанол - уксусная кислота - вода trliS (верхняя фаза), проявление хлор-толидиноеыи реактивом В-Аргинин eajonpecCHH - аазолрессорное действие, окситочин - действие на гпадхуа мускулатуру натки крмси