Штамм бактерий АснRомовастеR aGILe - продуцент рестриктазы AaG 525 I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в экспериментальной работе в области молекулярно-геметических исследований, в микробиологической промышленности.

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом.

Поиск штамма-продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода тестирования активности в толуольных экстрактах микробных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле.

Штамм Achromobacter agile 525 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится под Ms BKM-525 КМ МГУ (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов).

Штамм Achromobacter agife 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза Аад 5251, изошизомер Clal, узнает последовательность нуклеотидов А Т С G А Т и расщепляет ДНК фага А в 15 участках, Ad 2 в двух, pBR322 в одном и не

О

Ьь

00

ю

V4 Os

гидролизует ДНК обезьяньего вируса SV 40 и ОХ 174;

Эндонуклеаза рестрикции Аад 5251 является ценным инструментом для работ в области генетической инженерии. Фермент имеет один участок узнавания на наиболе распространенном в генетической инженерии векторе для клонирования плазмиде pBR322, причем сайт рестрикции локализуется в области гена, ответственного за ус- тойчивость к тетрациклину. Таким образом, клонирование ДНК в данном участке при помощи Аад 5251 в значительной степени облегчается возможностью проведения селекции рекомбинантов по фенотипу Тс (чувствительность к тетрациклину).

Характеристика штамма.

Морфологические свойства,

Палочки размером 0,7 х 2-4 мкм обычно расположены поодиночке, подвижны, грамотрицательны.

Культурально-биохимические свойства,

На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на чашке Петри с мясо- пептонным агаром мелкие, блестящие, края ровные. На мясопептонном бульоне на дне пробирки осадок, среда прозрачная.

Отношение к кислороду: строгий аэроб.

Желатина уколом - очень медленное разжижение.

Чувствительность к антибиотикам: культура чувствительности ко многим антибиотикам, резистентна к пенициллину, стрептомицину, полимиксину.

Условия выращивания и хранения.

Культура хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: бульоне Хотгингера, среде LB. При культивировании на среде LB наблюдается продолжительная лаг-фаза. Оптимум роста при.37°С. Зона рН роста культуры лежит в пределах 4,6-9,5. Оптимум роста культуры и образования фермента при рН среды 7,2-7,4, При рН 10,0 культура не растет.

Культура типична для Actiromobacter agile.

Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI,

1 Г К2НР04, ДО 1 Л ВОДЫ.

Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках.

П р и м е р 1. Культуру Achromobacter agile, штамм 525 предварительно адаптируют на питательной среде, содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера,

5 г NaCI, 1 г К2НР04, до 1 л воды, при 37°С в течение ночи. Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10, и размножают в условиях аэрации.

Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С в условиях аэрации. рН среды 7,2-7.4.

Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,4- 7,6.

Выращивание продолжают до фазы замедления роста.

Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы Аад 5251 6000 ед/г биомассы.

Определение активности фермента проводят экспресс-методом в толуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК.

Выделение эндонуклеазы рестрикции Аад 5251.

5 г биомассы Achromobacter agile 525 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4°С. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1 %-ным полиэтиленимином, а затем в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран. Обогащенный рестриктазой экстракт хроматографируют в калийфосфатном буфере в градиенте КС1 на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), затем на колонках с гепаринсефарозой и голубой сефаро- зой (фирмы Фармация).

Получают 8,5х 103ед. фермента в 2,5 мл глицеринового буфера. Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 12 мес. Выход очищенного препарата рестриктазы Аад 5251 составляет 1,7 х 103 ед. на 1 г сырого веса биомассы.

Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 2. Культивирование штамма A. agile 525 проводят аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1 л 10 г трип- тона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCJ и до 1 л воды.

Выход биомассы 4 г/л культуральной жидкости.

После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Аад 5251 1,9 х 103 ед/г биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251.

Поиск новой рестриктазы проводился путем скрининга у 150 штаммов различных видов бактерий.

Биомасса штамма A. agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 - A TIC G А Т, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: со

держание рестриктазы в биомассе 5000-6000 ед. на 1 г сырой биомассы.

Для изошизомера Аад 5251 - рестриктазы Cta 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырого веса биомассы.

Выход очищенного фермента Аад 5251 (1,7-1,9) х 103 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает известные цифры для Cta 1 (430 ед).

Формула изобретения

Штамм бактерий Achromobacter agile ВКМ 8-525 - продуцент рестриктазы Аад 5251.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молеку- лярно-генетических исследованиях, в микробиологической промышленности. Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом. Штамм-продуцент Achromobacter agile 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Achromobacter agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК5 -AT CGAT -3 , в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе 5-6 х 103 ед/г сырой биомассы. Для изоши- зомера Аад 5251 - рестриктазы Cla 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Аад 5251 составляет (1,7-1,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает выход известной рестриктазы Cla 1 (430 ед). Ј