Способ получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов Советский патент 1988 года по МПК A61K35/14 

ас со

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Кровь лошади обрабатывают гепарином. После отстаивания верхний слой отделяют и центрифугируют. Осадок, содержащий клеточную популяцию, суспендируют в фосфатном буфере и центрифугируют. Полученный осадок гранулоцитов суспендируют и гомогенизируют. Гомоге- низат центрифугируют и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой менее 10000. Фильтрат лиофилизи- руют, растворяют в растворе кислого карбоната аммония и подвергают гель- хроматографии. Осажденную фракцию отделяют и лиофилйзируют. Вещество, выделенное из гранулоцитов, тормозит размножение только миелоидных клеток. 2 табл. СО

см

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения эффективных веществ из здоровых клеток крови.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

Здоровые белые кровяные тельца, полученные из крови животных или человека, предпочтительно из крови лошади, гомогенизируют в буферном растворе рН 7-8, жидкий гомогенизат центрифугируют, из жидкой части выделяют растворимые составные части с молекулярной массой менее 10000 с помощью молекулярного фильтрования и затем эту фракцию подвергают дальн ейшему фракционированию путем гель-хроматографии. Вьщеляют фракцию, осаждаюп у- юся между объемными значениями Vg/VQ 1,15 и 1,45, и лиофилизируют.

Кроме того, способ может быть осуществлен следующим-образом.

Органы животных, предпочтительно телячью селезенку, содержащие грану- лоциты, гомогенизируют в смешивающемся с водой растворителе, предпочтительно в ацетоне. Из полученной жидкой суспензии выделяют твердое вещество путем центрифугирования, экстрагируют растворяющим жир органическим растворителем, преимущественно хлорсодержащим углеводородом, твердый остаток экстрагируют водой (нерастворимую часть целесообразно отделять центрифугированием) и из полученной жидкой части выделяют растворенные составные части с молекулярной массой менее 10000 путем молекулярного фильтрования. Эту фракцию подвергают дальнейшему фракционированию, преимущественно путем гель-хроматографии. Отделяют фракцию осаждающуюся между значениями Vg/v 1,3 и 2,5, и лиофилизируют последнюю.

Затем полученный по одному из приведенных вариантов способа или продукт (фракция G1-3) очищают хромато- графическим методом или бумажным электрофорезом и вьзделяют положительно реагирующий на хлортолидин пептид (белок), показывающий отрицательный заряд при рН 6,5 и относительную подвижность между -0,55 и -0,65, считая на аспарагиновую кислоту, и отсутствие заряда при рН 1,9 и подвижность

5

0,26, считая на -ДНП-лизин, после чего лиофилизируют.

Пример 1. Получение фракции G1-3 и-з крови лошади.

10 л крови лошади обрабатывают 3500 ед/л гепарина, затем для седиментации выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Верхний богатый лейкоцитами слой отделяют и центрифугируют при 800 g. Полученную в качестве осадка .содержащую 80% гра- нулоцитов клеточную популяцию затем суспендируют в 200 мл 0,06 М фосфат5 ного буферного раствора с рН 7,4

(состав: 9,500 г двуосновного кислого ортофосфата натрия, и 1,815 г двуосновного кислого ортофосфата калия в 1 л дистиллированной воды) и вновь

0 центрифугируют при 800 g. Полученньш осадок гранулоцитов суспендируют в таком же фосфатном буферном растворе в концентрации 410 клеток/мл и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера

5 при 10 об/мин.

Полученный гомогенизат центрифугируют при 1550 g и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию через мембрану Амикон РМ 10 под давлением 3 атм, отделяя фракцию с мо-: лярной массой менее 10000. Долучен- ный фильтрат лиофилизируют, лиофили- зат растворяют в буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и подвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс-G 10. Фракцию,осажденную между значениями Vg/v 1,15 и 1,45, отделяют и лиофилизируют. Таким образом получают 65 мг кон0 центрата эффективного вещества (фракция G1-3) в виде белого порошка.

П р и м е р 2. Получение фракции G1-3 из селезенки теленка.

1000 г очищенной и измельченной селезенки теленка смешивают с охлажденным до 4°С ацетоном до получения общего объема 4 л, смесь гомогенизируют при этой температуре в течение 60 мин, инкубируют и затем центрифугируют. Отделенное твердое вещество, промывают и высушивают в вакууме при 20°С.

Сухое твердое вещество экстрагируют 2 л хлороформа в течение 30 мин, затем твердое вещество отделяют, вы- сушивангг при комнатной температуре в течение 16 ч, после чего перемешивают с 3 л дважды дистиллированной воды и центрифугируют при 20000 g.

0

5

0

5

Отделенную жидкость лиофилизируют, лиофилизат растворяют в 0,05 М буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и прдвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс G-15, Фракцию, осажденную между значениями Vg/Vjj 1,3 и 2,5, отделяют и лиофилизируют. Таким образом получают 3,54 концентрата эффективного вещества G1-3 в виде белого порошка.

П р и м е р 3. Получение чистого эффективного вещества GP.

300 мг концентрата эффективного вещества G1-3 ( полученного по примеру 1 или 2) наносят на хроматогра- фическую бумагу ватман 3 мм (исходный пункт расположен в середине листа, и общее количество нанесенного образца распределяется по длине 30 см). Электрофорез проводят в буферной смеси из пиридина, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 90:4:900 (рН 6,5) в аппарате для электрофореза с горизонтальным расположением с градиентом напряжения 50 В/см в течение 2 ч. Положение кислого положительно реагирующего на хлор и отрицательно на нингидрин компонента определяют по окраске хлортолидином. Полученный таким образом активньш компонент элюируют с бумаги буферной смесью из уксусной и муравьиной кислот и воды в объемно соотношении 8:2:90 (рИ 1,9) ив такой же буферной смеси подвергают дополнительному электрофорезу с градиентом напряжения 80 В/см в течение 90 мин. Положение активного.компо- нента определяют с помощью хлортоли- дина. Активный компонент элюируют такой же буферной смесью (рН 1,91)

Селективное действие 100 мкг/мл GP. на введение 3 Н-тимидина в кислотонерастворимую дезоксирибонуклеиновую кислоту в культурах костного мозга и Thjraius

12 14

53,2 59,9

67837

и элюат лиофилизируют. Таким образом получают 8 мкг чистого эффективного вещества GP в виде белого по- V рощка.

П р и м е р 4. Получение действующего материала GP из крови теленка.

Из 10 л дефибринированной крови теленка посредством спонтанного осаж- 10 дения вьщеляют фракцию, содержащую 86% гранулоцитов и 14% одноядерных клеток. Затем гемолизуют в течение 5 мин 0,85%-ным раствором хлорида

аммония, центрифугируют, осадок про- мывай(т физиологическим раствором поваренной соли. Полученные таким-образом клетки гомогенизируют в буферном растворе и обрабатывают, как в примере 1.

П р и м е р 5. Получение действующего материала GP из крови человека. 1 л крови от здоровых доноров,при- надлежащей к одной группе, подвергают осаждению при 4°С в течение 4 ч. Полученные белые кровяные тельца содержат примерно 75% гранулоцитов и 25% лимфоцитов. Затем клетки гомогенизируют в буферном растворе и обра- батьтают, как в примере 1.

При этом по примерам 4 и 5 получено соответственно 60 и 5,6 мг концентрата активного вещества, обработанного, как в примере 3, с теми же характеристиками.

Результаты опытов, проводимых in vitro для определения эффективности выделенного с помощью ионообменной хроматографии или бумажного электрофореза эффективного вещества GP в - сравнении с фракцией G1-3, приведены в табл. 1 и 2.

Таблица 1

0,001

14,6 7,3

0,2

Таблица2

100 430

8 90

GP

2,5

7,8

0,2 1,6

МЭК - минимальная эффективная концентрация.

Следовательно, полученное в соответствии с изобретением эффективное вещество GP можно применять в качестве биологического эффективного вещества для торможения пролиферации йормальных или лейкемических кровяных клеток человека или клеток костного мозга in vitro в концентрациях от 0,2 до 10,0 пмоль/мл.

Новое вещество, выделенное из гранулоцитов вьшеописанным способом в лиофйлизированной форме (эффективное вещество GP), обладает более эффективным действием: оно тормозит специфически размножение миелоидных клеток, но является неэффективным по отношению к нормальным тимоцитам, ПХА-стимулируюЕцим лимфоцитам, суба- кутным Лимфоидным лейкемическим ти367837б

моцитам, человеческим лимфоидным лейкемическим кровяным клеткам и Helia человеческим опухолевым клеткам.

Частично очищенная фракция G1-3, полученная в качестве промежуточного продукта в соответствии с предлагаемым способом, содержит также эффективное вещество GP, но не в чистом

Q виде, а совместно с различными активными компонентами и, в основномs со значительным количеством неактивных примесей, такую же фракцию получают и по способу-прототипу. Данная

15 фракция обладает также тормозящим действием против размножения миело-, идных клеток; in vitro минимальная эффективная доза фракций G1-3 при торможении внедрения Н-тимидина в

2Q кислотонерастворимую ДНК 110 мкг/мл, в случае колоний - 8 мкг/мл.

Формула изобретения

Gnoco6 получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов, путем выделения из крови человека или телят гранулоцитон или лимфоцитов, гомогенизации, центрифугирования гомогенизата в изотоническом .водном растворе с последующим отделением жидкой фазы, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве сырья используют кровь лошадей, которую гомогенизируют в буферном растворе с рН 7,4, затем после центрифугирования жидкую фазу подвергают молекулярному фильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой не менее 10000, после чего вьщеленную фракцию наносят на хрома- тографическую колонку и отделяют

фракцию, осаждающуюся иежду значениями VB/VO 1,15 и 1,45, которую лио- филизируют и затем очищают методом хроматографии и/или бумажным электрофорезом с последующей повторной лио- филизацией.