Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов Советский патент 1988 года по МПК C07H21/00 C12N11/14 

1 . . 1

Изобретение относится к химии полимеров, а именно к способу получени носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов и может быть исполь зовано в биоорганической химии и био .технологии для синтеза олигонуклеотидов как в ручном, так и в автоматическом режиме.

Целью изобретения является повы- шение количества иммобилизуемого нук леозида.

Пример 1. К1г пористого стекла CPG-10 (удельная поверхность 17 м./г, диаметр пор 2200 А, размер частиц 120-20 мк) добавляют 30 мл концентрированной азотной кислоты, выдерживают 2-3 ч, отмывают водой до нейтрального рН. Затем добавляют 10 мл 0%-ного водного раствора D- маннита (ч,д.а.), дегазируют, перемешивают в течение 1 ч, дважды отмывают на пористом стеклянном фильтре 10 мл воды и трижды 10 мл диоксана. Далее добавляют 20 мл диоксана, 0,2 1-ш О BFg (ч), перемешивают 5 мин, добавляют 0,2 мл эпоксидной смолы ДЭГ-i (динамическая вязкость не более 15-30 сП, мол.масса 240 - 260, содержание эпоксидной группы 24%) и интенсивно перемешивадот в течение 40 мин при комнатной температуре, затем отмьшают диоксаном, водой, пиридином. К О, г обработанного таким образом стекла добавляют 0,1 ммоль 5 -о-диметокситритил-N- изо-бутирилгуанозина-3 -о-сукцината (DMTrGiBu), 0,3 ммоль TPSC1, 0,9 г-мол Melm и 0,2 мл абс. пиридина, осторожно перемепашают в течение ч. После этого носитель промывают пиридином, хлорофорг-1Ъм, ацетоном и сушат.

EjMKOCTb по нуклеозиду (количество иммобилизованного нуклеотида) на носителе определяют спектрофотометриче ски по диметокситритилкарбинолу (DMTrOH) после снятия с носителя ди- метокситритильной группы обработкой раствором хлорной кислоты в этиловом спирте (3;2 V/V) при длине волны 499 ни, коэффициент экстинции DMTrOH

71 7 .

ммольсм

Расчет содержания нук теозида на носителе проводят по формуле

С

D V

1000 Е m . 1

082

где С - содержание нуклеозида - со держание диметокситритильной группы на носителе, ммоль/г; D общая оптическая плотность

элюата с DMTrOH; V - объем элюата, мл; Е - коэффициент экстинции DMTrOH

при 499 им;

m - навеска носителя, г; 1-1 см - длина оптического пути кюветы, в которой измеряю оптическую плотность. Определение содержания нуклеозида на полученном носителе. К 0,01 г носителя, содержащего DMTrGiBu-группы, добавляют 2 мл-раствора хлорной кислоты в этаноле, раствор приобретает оранжевый цвет, вьщерживают 1-2 мин, отфильтровЕлвают, операцию повторяют, Элюаты объединяют и измеряют оптичес плотность на спектрофотометре: D 55,56, V 4 мл, m 0,01, содержание нуклеозида С - 0,310 ммоль/г. П р и м е р 2, К 0,1 г CPG 10, обработанному В маннитом и ДЭГ-1, к как описано в примере I, добавляют 0,1 ммоль 5 -о-диметокситритилтими- дин-3 -о-сукцината, 0,3 ммоль TPSC1, 0,9 №юль Melm, 0,2 мл абс о пиридина, осторожно перемешивают в течение 1 ч о Затем промывают пиридином, хлороформом, ацетоном и сушат. Содержание нуклеозида определяют как в примере 1„ D 80,66, m 0,01 г, V 4 мл, С 0,450 ммоль/г с

Пример 3, пористого стекла МПС 2000 ( 15-20 мг/г, 2000 А, d,,,, 100-300 мк), прибавляют 10 мл 5%-ного раствора В-маннита, дегазируют и перемешивают в течение 1 ч. Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1, Содержание нуклеозида на носителе определяют как в примере 1, D 54,85, V 4 мл,- m 0,01 г, С 0,306 ммоль/г.

Пример 4. 1г пористого стекла МПС 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 10%- ного раствора D-маннита берут 16%-ны раствор. Содержание нуклеозида определяют как в примере 1. D 75,46, V 4 мл, m 0,01 г, С 0,421 ммоль/

Пример 5. 1 г пористого стекла CPG 10 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 0,2 мл ДЭГ-1 добавляют 0,4 мл эпоксидной

1А

смолы. Содержание нуклеозида на носителе составляет 0,352 ммоль/г.

Пример 6 (контрольный), 1 г пористого стекла МПС 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 10%-нога раствора D-маннита берут 2%-ный раствор. Содержание нуклеозида, определенного аналогично

примеру 1 0,126 ммоль/г.

Пример 7 (контрольный). 1 г пористого стекла CPG 10 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 0,2 мл ДЭГ-1 берут 0,1 мл эпоксидной смолы. Содержание нуклеозида О,150 ммоль/г.

084

На носителе, полученном в примере 2, синтезируют октадекадвзоксири- бонуклеотид d (ААААТАСТССАТСАСССТ) фосфотриэфирным методом. Средний выход на стадию по DMTrOH 84%, а общий выход после хроматографического выделения 1,20% от теоретического..На носителе, полученном в примере 2, синтез ируют ок таде з оксириб онуклеотид d (СССССТАС) фссфитньш методом. Ср ед- ний выход на стадию по DMTrOH 90%, а общий выход после хроматографического выделения 20% от теоретического.

Характеристики предлагаемых и известных носителей приведены в таблице.

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать носители для твердофазного синтеза олиго- нуклеотидов, содержащие 0,310 - 0,450 ммоль иммобилизованного нукле- озида на Г г носителя. Носители получают последовательной обработкой кремнезема 5-16%-ным водным раствором D-маннита, -2%-ным раствором эпоксидной смолы ДЭГ-1 в диоксане и нуклеозидом, 1 табл. (Л 4 00 ;о

Пример 8. 1 С-20 15-25 мг/г.

г силохрома d,

1300 А, d

пор.

чист

315-500 мк) обрабатывают азотной кислотой, отмывают водой до нейтрального рН как в примере 1, затем промывают диоксаном, до- баЪляют 20 мл диоксана, 0,2 мл эфира- та трехфтористого бора, перемешивают 5 мин, добавляют 0,4 мл ДЭГ-1, интенсивно перемешивают 40 мин при комнатной температуре, затем отмывают диоксаном, водой, пиридином. К обработанному таким образом кремнезе1 гу (0,1) присоединяют нуклеозид аналогично описанному в примере 1. Содержание нуклеозида 0,003 ммоль/г.

Формул

изобретения

20

5

0

Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеоти- дов, включающий обработку кремнезема полимером и н тслеозидом, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения количества иммобилизуемого нуклеозида, кремнезем перед нанесением нуклеозида предварительно обрабатывают 5-16%-ньш водным раствором D-маннита и 1-2%-ным раствором в ди- оксане зпоксидной смолы на основе полиола и эпихлоргидрина в присутствии трехфтористого бора.