Способ выделения урокиназы из биологических источников Советский патент 1985 года по МПК A61K38/49 C12N9/12 

СП

о

О)

ел Изобретение относится к произво ству ферментных препаратов тромболитического действия, а именно ,-к способу получения урокиназы, приме няемой в медицинской практике, пре имущественно при тромбоэмболически заболеваниях. Известен способ выделения уроки назы, включающий очистку фермента с использованием сульфатаммонийного осаждения, многократного, центри фугирования, гельфильтрации на сефадексах, ионообменной хроматографии .l. Недостатки способа состоят в мн гостадчйности, трудоемкости и длительности процедуры. Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату способ очистки урокиназы, включающий гидрофобную и аффинную хроматографию биологических источников фермента 2. Основные недостатки способа зак чаются в необходимости предварител ной концентрации выделяемого фермента и использовании обогащенных биологических источников. Цель изобретения - увеличение удельной активности целевого проду та. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделени урокиназы из биологических источни ков, включающему гидрофобную хроматографию, хроматографию проводят дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 20%-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осу ществляют формиатным буфером рН 4, причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществляют при рН7,0 а вторую - при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией. Использование гидрофобного носителя позволяет избирательно и пр тически полностью извлечь фермент, а путем изменения условий сорбции при повторной хроматографии удаляю ся балластные белки. Способ вьаделения урокиназы осуществляется следующим образом. К среде кондиционирования клето почек человека RH добавляют сульфат аммония до 20%-ного насьщения и доводят рН раствора 1 М трис до 7,П..Раствор пропускают через колонку, упакованную гидрофобным сор бентом и бензилсефарозой и уравновешенную и,1 М трис-НС1 буфером 7,0, содержащим 0,4 М Had и 20% сульфата аммония. Колонку промьгеают уравнорешивающим буфером и элюируют урокиназу формиатным буфером рН 4,0. На второй стадии к элюату добавляют сульфат аммония до 20%-ного насьпцения, сорбируют его на той же колонке с бензилсефарозой, уравновешенной -0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20% сульфата аммония. Колонку промывают уравновешивающим буфером. Урокиназу элюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0. Окончательную очистку осуществляют гель-фильтрацией на ультрагеле АсА 54. Белки элюируют 0,05 М трис-НС1 рН 7,5, содержащим 0,2 М NaCl. Фракции, содержащие урокиназу, диали уют и лиофильно высушивают. Пример 1. К 1 литру среды кондиционирования культуры клеток почек человека RH, содержащей 35 ME урокиназы на 1 мл, добавляют 106 г сульфата аммония до 20%-ного насыщения, подводят рН до 7,0 1 М трис. Раствор наносят на колонку 1-7 см, упакованную 20 мл бензилсефлрозы, которая предварительно уравновещена 0,1 М трис-НС1 буфером рН 7,0, содержащим 0,4 М NaCl и 20% сульфата аммония. Все процедуры проводят при комнатной температуре. Скорость нанесения среды кондиционирования 250 мл/ч. Колонку промывают с такой же скоростью уравновешивающим буфером до полного прекращения вымывания красителя, содержащегося в среде кондиционирования, и белков, не связавшихся со смолой. Урокиназной активности в этих фракциях не обнаружено. Связанный на колонке i фермент злюируют 0,05 М формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч. Удельная активность урокиназы после первой стадии очистки составляет 3800 МЕ/мг. Выход 92%. На второй стадии к 16 мл полученного раствора урокиназы добавляют 1,6 г сульфата аммония до 20%-ного насыщения. Вторую хроматографию проводят на той же колонке с бензилсефарозой, но уравновешенный 0,05 М формиатным буфером рН 4,0, содержащим 20% сульфата аммония. После нанесения раствора белка колонку промьтают 100 мл уравновешивающего буфера со скоростью 250 мл после чего урокиназу элюируют 0;,05 формиатным буфером рН 4,0 со скоростью 40 мл/ч. Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки состав ляет 42000 МЕ/мг. Выход 76%. Сконцентрированный ультрафильтрацией на амиконе (фильтр РМ-Ю до 2 мл раствор урокиназы наносят на колонку 1-57 см, упакованную ультрагелем АсА 54 и уравновешенную 0,05 М трис-НС1 буфером рН 7,5 содержащим 0,2 М NaCl. Скорость эл ции белков 7 мл/ч. Фракции, содерж щие урокиназную активность, диализуют и лиофильно высушивают. Удельная активность препарата после последней стадии очистки сос тавляет 190000 МЕ/мг. Выход 64%. Прим ер 2.-Ц качестве исход ного сырья используют обедненную среду кондиционирования культуры клеток почек человека RH, содержащую 3 ME урокиназы на 1 мл. На первой стадии аналогично при меру 1 получают урокиназу с удельной активностью 3350 МЕ/мг. Выход 95%. Удельная активность урокиназы после второй стадии очистки состав ляет 38000 ME/мл. Выход продукта 7 После последней стадии очистки удельная активность урокиназы 120000 МЕ/мл. Выход 68%. П р и М е р 3. Третьи порции среды кондиционирования культуры клеток почек человека RH объемом по 200 мл каждая с суммарной активностью урокиназы 5600 МЕ/мл (удельная активность 28 МЕ/мл обрабатывают аналогично примеру 1 на первой стадии хроматографии, но с измененной конечной концентрацией сульфата аммония на каждую порцию соответственно 10, 20 и 30%. Вьгход продукта соответственно составляет 41,92 и 89% с активностью урокиназы в каждой конечной порции:2300, 5150 и 5000 МЕ/мл. Максимальный выход продукта достигается при концентрации сульфата аммония 20%. Предлагаемый способ обеспечивает получение препарата урокиназы из обедненных сред кондиционирования, содержащих урокиназу до 3 МЕ/мл; отличается быстротой очистки (до 1 сут ) и высокой удельной активностью получаемого препарата урокиназы в результате исключения нескольких трудоемких процедур, таких как предварительная концентрация, диализ и центрифугирование, так как одновременно осуществляется концентрация и очистка фермента. По сравнению с известными предлагаемый способ значительно упрощен, поскольку на двух стадиях процесса используется одна и та же хроматографическая колонка.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ УРОКИНАЗЫ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ, включающий гидрофобную хроматографию, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности целевого продукта, хроматографию проводят дважды на колонке с бензилсефарозой в присутствии 20%-ного сульфата аммония, а элюцию урокиназы осуществляют формиатным буфером рН 4,0, причем первую сорбцию урокиназы на носителе осуществляют при рН 7,0, а вторую - при рН 4,0 с последующей гель-фильтрацией.