Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генной инженерии.
Целью изобретения .является получение штамма, продуцирующего только метипазу Sso II, без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровня синтеза метилазы Sso II в клетках бактерий.
Сущность изобретения состоит в том, что получена рекомбинантная плазмидная ДНК, обуславливающая синтез метилазы Sso II,и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы Sso II.
Полученная плазмида d 33 состоит из следующих элементов: плазмидная ДНК вектора pUC19, размер которой
2,69 т.п.о., плазмидная ДНК Р4 из S. sonnei 47, кодирующая метилазу Sso II, размер которой 4,4 т.п.о.
Способ конструирования плазмиды заключается в том, что плазмидную ДНК вектора PUC19 гидролизуют эндо- нуклеазой рестр}псции BamHI и соединяют ДНК-лигазой с плазмидной ДНК Р4 гидролизованной рестриктазой Bgl II. Затем смесь соединенных фрагментов ДНК обрабатывают рестриктазой Ват KI и трансформируют в клетки Е. соП
О1 00 I4S
Сл 00
PS200. Трансформанты высевают на сре- д/ с ампициллином и из выросших клонов Взщеляют плазмиду, обозначенную как d 33..
Используют штамм бактерий Е. coli BJ834 (Гд, тр, несущий плазмиду d 33 И продуцируют метилазу 5sо II.
Штамм-продуцент метилазы Sso II
Полученной смесью трансформируют клетки Е. coli pS 200, для чего 50 мкл суспензии Е. coli PS 200 вно- сят Б 20 мл питательного бульона LB, выращивают до титра 7x10 кл/мл при во флаконе объемом 200 мл. После чего суспензию клеток охлаждают во льду в течение 10 с и центрифугируют
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обусловливающую синтез метилазы SSOLL, и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент метилазы SSOLL. Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего только метилазу SSOLL без сопутствующей рестриктазы, а также увеличение уровня синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий. Получен штамм, продуцирующий только метилазу SSOLL без рестриктазы, и повышен уровень синтеза метилазы SSOLL в клетках бактерий в 40 раз по сравнению с используемым ранее. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.
получен трансформацией клеток Е. coli JQ при 5000 g 15 мин при 4 С Суперна,11834плазмидой d33. Содержание метилаз
so II в сконструированном штамме laBHo 300000 ед. на 1 г биомассы клеток ..
Пример. . Получение плазмиды dl 33. Плазмидную ДНК из штамма Е, coli XS13, содержащую две гпазмиды: Р4 (2,8 МЛ) и Р9 (100 МД), выделяют щелочным методом. Шгазмид- ьую TpIK Р4 отделяют от высокомоле- кулярной ЛНК Р9 с помощью хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Качество р азделения плазмид анализируют эле- ктрофорезом. В очищенных препаратах глазмидной ДНК Р4 присутствие плаз- Р9 не выявляется.
Плазмиднуго ДНК Р4 и ДНК вектора IUC19 используют для конструирования глазмиды d 33, которое проводят сле- д:.У1ощим образом: 0,5 мкг вектора pU (11.9 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции Ват HI (5 ед.) в буфере А 100 мМ NaCl, 50 мМ трис-НС1, рН ,5, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол)
мкг плазмидной ДНК Р4 инкубируют с рестриктазой Bgl II (10 ед.) в бу пере 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 1 IlgCl г, 1 мМ дитиотрейтол. Инкубацию проводят при 37°С в течение 1 ч. ;атем пробы прогревают в течение
5 мин при 65 с и анализируют полно- гу гидролиза с помощью электрофореза Соединение ДНК плазмиды и вектора проводят в буфере, содержал ем 0,05 М
фИс-HCl, рН 7,4, 0,01 MMgCl.,, 0,,01 М 45 рестрикционному анализу.
Характеристика щтамма
.щтиотрейтол, 0,1 мМ АТФ ДНК-лигазу ij)ara Т4 (100 ед/мп) добавляют из засчета 0.,5 мкл ферментЯ на 5 мкг ДНК. Лробу инкубирзпот 12 ч при 10°С.
Затем в смесь соединенных фрагмен- сп санному в примере, получают штаммtroB добавляют 1 мкг 0,5 М ЭДТА, экс- |грагируют равным объемом хлороформа, ереосаждают 2,5 объемами этанола, по- рле растворения осадка ДНК пробу ин- убируют 12 мин при 65°С и обрабаты-- j, ают 10 ед. рестриктазы BatiiHl в буфе- |ре А в течение 1 ч при 37°С с целью |обогащения смеси соединенных фраг- Центов гибридными молекулами ДНК,
продуцент метилазы Sso II.с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.
Штамм Escherichia coli В834, несущий плазмиду d 33 (гg, m) - продуцент метилазы Sso II характеризуется следующими признаками.
Культурально-формологические приз наки.
тант сливают. Осадок суспендируют в 1/2 объема 0,1 М CaCl После 40 мин инкубации во льду клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют осадок в 0,5 мл 0,1 М CaCl. Суспензию клеток выдерживают во льду 10- 12 ч, затем используют для трансформции.
К 200 мкл суспензии клеток в CaCl добавляют 20 мкл смеси соединенных фрагментов ДНК и выдерживают 40 мин во льду, затем на 90 с помещают в ледяную баню с температурой 42°С, после чего еще на 2 мин в лед. Суспензию разводят в 10 раз бульоном LB и инкубируют 1 ч при , после чего высевают на чашки с ампициллином (50 мкг/мп). Из выросщих клонов вьщеляют плазмидную ДНК. обозначенную как d 33 э содержащую в своем составе вектор pUC1 95 несущий ген Ыа, который детерминирует синтез р-лактамазы и плазмидную ДНК Р4, несущую ген метилазы Sso II, определяющий синтез метилазы Sso II, Сайт узнавания рестриктазы Bgl II лежит. вну-Три последовательности гена рестриктазы Sso II, поэтому при клониро- вании происходит встраивание внутрь гена рестриктазы ДНК вектора pUC19, разобщающей этот ген, и синтеза рестриктазы Sso II в клетках, несзщих плазмиду d 33, не происходит.
Плазмидную ДНК d 33 подвергают
Характеристика щтамма.
Плазмиду d 33 трансформируют в штамм Е. coli В834 по методу, опипродуцент метилазы Sso II.с активностью не менее 300000 ед/г биомассы клеток.
Штамм Escherichia coli В834, несущий плазмиду d 33 (гg, m) - продуцент метилазы Sso II характеризуется следующими признаками.
Культурально-формологические признаки.
Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные, лакто- зопозитивные. При рассеве на чашки с 1,3%-ным МПА рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (МПА, МПВ, LB-бульон и LB-arap).
Физиолого-бйохимические признаки. . Клетки растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованием кислоты, не .разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород.
Проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды d 33.
Уровень синтеза метилазы анализи- следукндим образом.
Культуру клеток E.coli В834, не- .сущих плазмиду d 33, выращивают в 1 л среды LB с 50 мкг/мл ампициллина при до титра 4 х 10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, 0,1 М NaCl, 7 мМ 2-медкаптоэтанол, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при 10 мин. Клетки разрушают ультразвуком. Экстракт получают центрифугированием при (48000 g) в течение часа.
Активность метилазы Sso II определяют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 мк S-аденозилме- тионина и 5 мкл каждого из десятикратных разведений супернатанта. Инкубацию проводят в течение различных вре1. Рекомбинантная ппазмидная 7ШК d 33, кодирующая метипазу Sso II, молекулярной массой 4,5 МД и размером 7,1 т.п.о., содержащая плазмидную ДНК вектора PU С19 размером 2,7 т.п.о плазмиднуш ДНК Р4 с геном метилазы Sso II размером 4,4 т.п.о один учаменных промежутков от 1 до 24 ч при . Пробы наносят на фильтры GF/C, 45 разщепления эндонуклеазами С1а I, осаждают 5%-ной трихлоруксусной кисло- EcoR V, Sac 11, Pst I, Sph I, Hind III, той, отмывают 70%-ным этанолом, высушивают и просчитьгоают радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе. За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкг
S ас I, Крп I, Sma I. ХЪа I, участка расщепления Cfr 101, SalG I, четыре участка расщепления EcoR I, Bla ген, 50 кодирующий -лактамазу,фрагменту гена lac, соединенные с синтетическим полилинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso. II j. состоящую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора .
акцепторной /ЩК за 24 ч.
Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е. coli Б834, не- сущем d 33, соответствует 300000 ед. на 1 кг биосмассы.
Ниже приведены значения уровней синтеза метилазы Sso II в штаммах
Е. coli, трансформированных плазми- . дои d 33.
ШтаммАктивность метилазы, ед/г
E.coli PS 200/d33 10000 E.coli B834/d33 300000
Рекомбинантная плазмида d 33 представляет собой высококопийную, имеющую удобный селективный маркер, векторную молекулу, несущую ген метилазы Sso II. Плазмида d 33 может служить основной для проведения работ, имеющих теоретическое значение - для изу- чеНйя характера метилирования Sso II и определения первичной структуры гена метилазы, а также для практических работ по созданию суперпродуцентов метилазы Sso II.
Штамм бактерий Escherichia coli В834, трансформированный плазм1-щой d 33, является эффективным про.дуцен- том метилазы Sso II (уровень активности метилазы - 300000 ед. на 1 г биомассы). При этом в штамме. E.coli В834 не продуцируется рестриктаза Sso II. сопутствующая метилазе Sso II, близкая по физико-химическим параметрам к белку метилазы Sso II. Этот факт позволяет при работе с этим штаммом использовать наиболее легкую технологически схему очистки метилазы Sso II.
рмула изобретения
40
разщепления эндонуклеазами С1а I, EcoR V, Sac 11, Pst I, Sph I, Hind III,
S ас I, Крп I, Sma I. ХЪа I, участка расщепления Cfr 101, SalG I, четыре участка расщепления EcoR I, Bla ген, кодирующий -лактамазу,фрагменту гена lac, соединенные с синтетическим полилинкером, расположенные по обе стороны клонированной ДНК Р4, ген метилазы Sso II, расположенный на клонированной ДНК плазмиды Р4, детерминирующей синтез метилазы Sso II, последовательность гена рестриктазы Sso. II j. состоящую из двух фрагментов, расположенных по обе стороны ДНК вектора .
PU
СПС
эы
715325858
С19, которая, таким образом, не . 2. Штамм бактерий Escherichia coli 1собна определять синтез рестрикта- ГИСК, В834 - продуцент метипазы Sso II.Sso II.
