1-( @ -D-Ксилофуранозил)-5-трифторметилурацил, обладающий антигерпетической активностью Советский патент 1992 года по МПК C07D239/54 A61K31/513 A61K31/7072 A61P31/22 C07H19/09 

Изобретение относится к новому t производному 5-трифтормети.пурпцила, обладающему аитигерпетической актигию- стБЮ, которое может найти применение в медицине.

Цель изобретения - создание нового производного 5-трифторметилурацила, обладающего более избирательным анти- герпегическим действием и меньшей токсичностью.

Пример 1. Синтез 1-(-и-кси- лофураНозил)-5-трифторметилурацила (I).

Смесь 1,8 г (10 ммоль) 5-трифторметилурацила, 8,8 МП (50 ммоль) гек- саметилдисилазана и 0,2 мл диметил- дихлорсилана кипятят, защищая от влаги воздуха, на масляной бане при темфурп11(г.4ил) 5 трифтормстп.чурл1иии1; т.пл. 161-1 2 с.

Найдено, N 4,4А.

С 59, ДЗ, Н 3,81,

С 59,61, Н 3,68,

N

to

Сз,Н„ГзН,,0,. Вычислено, %: 4.61.

Н-спектр (ЦЖ:0- D + ТИС), м.д.

15

.J .-..„.. Н(3) 11,76 с. (1Н); бенэо- ильные группы и Н(6) В,,2П м. (16Н), Н(1 ) 6, 11 д. (Ifl); Н(2 , 3 5,84 м. (2il); Н(4) 4,96 м. (1Н); Н(5,5) А,72 м.(2Н).

Спектрометр BRUKER НХ-90, ФРГ. Рабочая частота 90 МГц.

ИК-спектр (пдста в вазелиновом масле), , Vr 1725 о. с. (бензоильгше группы); 1, о 1705 о.с

25

30

пературе 165-170 С в течение 1,5-2 ч. 20 с. (пиримидиновое кольцо), ., Раствор упаривают в вакууме на роторном испарителе при 50-60 с и полученное бурое масло перегоняют в вакууме (т.кип. 59°С/1,5 мм рт.ст.). К полученному 2,4-бис-триметилсилил-5- -трифторметилурацилу добавляют 130 мл абсолютного дихлорэтана, 4,0 г (8,8 ммоль) 1-0-ацетил-2,3,5-три-0- -бензоил-й-П-ксилофуранозы и 1,4 мл свежеперегнанного четыреххлористого олова. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре и затем нейтрализуют насыщенным раствором гидрокарбоната натрия до рН водной.фазы 8 и продолжают интенсивно перемешивать еще 1 ч. Реакционную смесь фильтруют через кизельгур, ки на фильтре дважды промывают ho 20 мл дихлорэтана. Орган|- 1еский слой отделяют, дважды промывают по 20 мл воды, сушат безводным сульфатам натрия и упаривают в вакууме при 40- . Получают 4,4 г (88,5%) пенообразной массы, которую растворяют в 20 мл горячей смеси хлороформа и метанола (2:1) и по каплям прибавляют гексан до образования сильной опалес- ценции. Раствор оставляют на сутки при темг1ературе 4 с. Выпавшие мелкие кристаллы отфильтровывают, промывают небольшой порцией холодного метанола, а затем гексаном. Выход 3,70 г (74,4%). Добавление к маточному раствору избытка гексана с последующим охлаждением позволяет получить дополнительно 0,40 г продукта.

1260 о.с.; (мепл. 710 о.с.

Спектрометр PERKIN-ELMER -437, ЬаВЕЦИЯ. тех: Rf 0,65 (пластинки Si fol UV-254, ЧССР, этилацетат - гёк сан 25:30).

Дебензоилирование 1-(2 ,3 ,5-три -0-бензоил-/}-0-ксилофураноз ил)-5-тр фторметилурацила проводят одним из двух способов.

Способ А. 1,87г(3 ммоль) 1-(2 ,3 ,5 -три-0-бензоил-уЗ-П-ксило фуранозил)--5-трифторметш1урацшга в 100 мл абсолютного метанола насьщают предохраняя от контакта с влагой возд

2g ха, сухим газообразным аммиаком при температуре от О до . Колбу пло но укупоривают и оставляют на 3-4 с в холодильнике при 2-4 с. Затем сероватый раствор осторожно упарива

40 в вакууме при 30-40 С. К полученном маслянистому остатку добавляют 25 м дистиллированной воды и пятикратно экстрагируют по 10 мл дихлорэтана. Водный слой фильтруют через фильтр,

g смоченный дистиллированной водой, и упаривают в вакууме при 30-40 С. К полученному сиропу добавляют 5 мл бензола, , 1 мл абсолютного этанола вновь упаривают. Операцию повторяют до тех пор, пока сироп не затвердее в пористую пенообразную массу. Полу чают 0,76 г (81,7%) неочищенного пр дукта, который растворяют в 5 мл су хого этилацетата, добавляют 2-3 кап гексана и оставляют на сутки при ко натной температуре. Затем к раствор с выпавшими кристаллами добавляют гексак по каплям до образования сла бой опалесценции, оставляют на сутк

50

55

Физиko-xммIlчecк re характеристики 1-(2-, З ,5 -три-0-беязо л-;ь-)-ксилофурп11(г.4ил) 5 трифтормстп.чурл1иии1; т.пл. 161-1 2 с.

Найдено, N 4,4А.

С 59, ДЗ, Н 3,81,

С 59,61, Н 3,68,

N

Сз,Н„ГзН,,0,. Вычислено, %: 4.61.

Н-спектр (ЦЖ:0- D + ТИС), м.д.

.J .-..„.. Н(3) 11,76 с. (1Н); бенэо- ильные группы и Н(6) В,,2П м. (16Н), Н(1 ) 6, 11 д. (Ifl); Н(2 , 3 5,84 м. (2il); Н(4) 4,96 м. (1Н); Н(5,5) А,72 м.(2Н).

Спектрометр BRUKER НХ-90, ФРГ. Рабочая частота 90 МГц.

ИК-спектр (пдста в вазелиновом масле), , Vr 1725 о. с. (бензоильгше группы); 1, о 1705 о.с.

с. (пиримидиновое кольцо), .,

с. (пиримидиновое кольцо), .,

1260 о.с.; (мепл. 710 о.с.

Спектрометр PERKIN-ELMER -437, ЬаВЕЦИЯ. тех: Rf 0,65 (пластинки Silu4, fol UV-254, ЧССР, этилацетат - гёк- . сан 25:30).

Дебензоилирование 1-(2 ,3 ,5-три- -0-бензоил-/}-0-ксилофураноз ил)-5-трифторметилурацила проводят одним из двух способов.

Способ А. 1,87г(3 ммоль) 1-(2 ,3 ,5 -три-0-бензоил-уЗ-П-ксило- фуранозил)--5-трифторметш1урацшга в 100 мл абсолютного метанола насьщают, предохраняя от контакта с влагой воздуха, сухим газообразным аммиаком при температуре от О до . Колбу плотно укупоривают и оставляют на 3-4 сут в холодильнике при 2-4 с. Затем сероватый раствор осторожно упаривают

в вакууме при 30-40 С. К полученному маслянистому остатку добавляют 25 мл , дистиллированной воды и пятикратно экстрагируют по 10 мл дихлорэтана. Водный слой фильтруют через фильтр,

смоченный дистиллированной водой, и упаривают в вакууме при 30-40 С. К полученному сиропу добавляют 5 мл бензола, , 1 мл абсолютного этанола и вновь упаривают. Операцию повторяют до тех пор, пока сироп не затвердеет в пористую пенообразную массу. Получают 0,76 г (81,7%) неочищенного продукта, который растворяют в 5 мл сухого этилацетата, добавляют 2-3 капли гексана и оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем к раствору с выпавшими кристаллами добавляют гексак по каплям до образования слабой опалесценции, оставляют на сутки

при комнатной температуре вновь добавляют гексан н помещают на сутки в холодильник. Полученные крупные кристаллы отфильтровывают и промывают гексаном. Выход 0,71 г (76,3%). Соединение 1 гигроскопично, его сушат и сохраняют в холодильнике, предохраняя от контакта с влагой воздуха. СпособБ, К1,87г(3 ммоль) 1 -(2 , 3 , 5 -три-0-бензош1-/5-П-ксилр- фуранозил)-5-трифторметилурацила дот бавляют 10 мл абсолютного метанола и при интенсивном перемешивании медленно приливают 7 мл охлажденного 1М раствора метилата натрия в метаноле. Через несколько минут раствор начинает густеть. Добавляют еще 25 мл абсолютного метанола и продолжа от перемешивание в течение 2 ч при температуре 30-35°С. Затем реакционную смесь охлаждают, нейтрализуют до- бавлением DOWEX-50 (Н), ионообменную смолу отфипьтровывают, .промывают на фильтре дважды по 5 мл метанола и дистиллированной воды. Далее выделение проводят аналогично способу А. Выход 0,57 г (61,3%). Т.пл. 163- .

Физико-химические характеристики соединения I. .

Найдено, %: С 38,58; Н 3, N 9,11.

С,вН,, FjNjO.

3,55;

Вычислено, %: С 38,47, Н N 8,97.

ЯМР С-спектр (DaO + ДСС),d , М.Д.: С(4) 162,2 с., С(2) 151,7

с.

После А8 ч экспозиции инфицированных клеток в отсутствие соединения I наблюдалось поражение 2/3 клеточного

С(6) 144,3:к. (I с-с-с-Р 5,5 Гц);

-CFj 123,2 к. (IC.P 270,0 Гц); С(5) 40 монослоя, вызванное развитием вирус-104,5 к. (IC-C-F 31,А Гц); С(1)

92,9 с, 0(4) 85,2 с., С(2 ) 81,4 с., С(3) 75,8 с, С(5) 60,6 с. Спектрометр BRUKER -WM-250, ФРГ. Рабочая частота 62,89 МГц.

ЯМР Н-спектр (DjO + ДСС), 6, м.д.: Н(6) 8,47 к. (1Н, IH.F 1,1 Гц); Н(1) 5,85 с. (1Н, IV,2 1,5 Гц); Н(4) 4,41 м., (1Н, I 4,5 , Гц, 1. у, 6,1 Гц) Н(2,3) 4,30 м. (2Н , I2 ,3 1,6 Гц, I V, V 3,4 Гц); Н(5;,5) 4,02 м. (2Н, I jo 55 12,3Гц).

Спектрометр BRUKER -WM--250, ФРГ. Рабочая частота 250 МГц.

ИК-спектр (паста в вазелиновом масле) , V , CM- :Vo-H 3425 ср., 1710 о.с., 1695 о.с., УС С ср., Vj.P 1280 с.

ного ЦПД. При концентрации 125 мкг/мл происходит существенное торможение репродукции вируса, выражающееся в значительной задержке ЦИД. Концентра- 5 ция соединения 1, разная 250 мкг/мл, на этот срок наб11юдения полностью предохраняет клетки, которые по своему внешнему в}аду не отличшшсь от контрольных, то есть незараженных клеток.

На 72 ч наблюдения в отсутствие соединения 1 иг .еет место 100%-ное ЦПД, сопровождающееся разрушением клеточного моиослоя. При копцеятрации соединения I 125 мкг/м.п и той же экспозиции отмечается аптивипуснс г действие, выражакицееся в залержке вирусного ЦПД. Однако защита K/IOTDK менее выражена по српнпошт) с ч сроком

50

55

10

15

Спектромет. PERKIN-ELMF,.7, Швеция,

УФ-спектр (HjO), Л „„КС , им (f): 201(1800); 262 (9590).

Спектрометр EPS-3T HITACHI, Япония. ТСХ: Rf 0,42 (пластинки Si- lufol UV-254, ЧССР, этилацетат). Высокоэффективная жидкостная хроматография; содержание примеси не более 0,5% (силасорб C,gLC, колонка: диаметр А,6, длина 130 мм, 100% ), Хроматограф VARIAN -8500, США.

П р и м е р 2. Определение анти- герпетттческой активности, цитостати- чес-кого действия и влияния на синтез клеточных макромолекул 1-((й-0-ксило фуранозил)-5-трифторметилурацш1а.

Изучение антигерпетической активности проводят в культуре клеток с использованием ВПГ-1, штамм L, а также штамма LjG (ТК) по общепринятой методике изучения антигерпетиче- ских препаратов, в соответствии с 25 которой определяют концентрацию препарата, вызывающую 50%-ное подавление репродукции В1фуса и на 50% защищающую клетки от цитопатогенного действия (ЦПД) вируса простого герпеса.

С этой целью соединение I изучают на антигерпетическую акт геность в ди апазоне концентраций 31-500 мкг/мп.

В качестве модели изучения антигерпетической активности используют культуру клеток VERO, множественность инфекци 0,001 ТЦ .

После А8 ч экспозиции инфицированных клеток в отсутствие соединения I наблюдалось поражение 2/3 клеточного

20

30

35

монослоя, вызванное развитием вирус-ного ЦПД. При концентрации 125 мкг/мл происходит существенное торможение репродукции вируса, выражающееся в значительной задержке ЦИД. Концентра- ция соединения 1, разная 250 мкг/мл, на этот срок наб11юдения полностью предохраняет клетки, которые по своему внешнему в}аду не отличшшсь от контрольных, то есть незараженных клеток.

На 72 ч наблюдения в отсутствие соединения 1 иг .еет место 100%-ное ПД, сопровождающееся разрушением клеточного моиослоя. При копцеятрации соединения I 125 мкг/м.п и той же экспозиции отмечается аптивипуснс г действие, выражакицееся в залержке вирусного ЦПД. Однако защита K/IOTDK менее выражена по српнпошт) с ч сроком

513А19496

наблюдения при той же концентрации. соединоння Т, равные 25, 250, 500 и

Концентрация соединения I, равная 1000 мкг/мл. При этом времени контак250 мкг/мл, обладает выраженным про- та в исследованном диапазоне конценттивовирусным действием, вызывая раций не отмечалось подавления синте подавление ЦПД более чем на 50%. i 5 белка, что указывает на отсутствие

или весьма незначительное влияние соТаким образом, изучение антигерпе- единения I на данный процесс, тической активности 1-(/з-В-кснпофура- Влияние исследуемого соединения I ноэил)-5-триф1 орметилурацила показы- на синтез ДНК изучалось на культуре вает, что на 48 и 72 ч каблюде- 10 клеток VERO. Использовалась общения составляют 110 и 210 мкг/мл соот- принятая методика, основанная на из- ветственно.мерении вкл1очения Н-тимидина в нукДля изучения цитостатического дей- леиновые кислоты.

ствия соединения I использовались две Действие соединения I на синтез линии клеток: VERO (культура клеток 15 РНК .изучалось по измерению включения почек зеленой мартышки), которая ши- Н-уридина в клетки VERO по анало- роко применяется в вирусологических гичной методике,

исследованиях, и Раушер/МХ - ориги- Влияние 1-(/ь-В-ксш1офуранозип)-5- нальная. Клетки засевают по 5 мл на -трифторметилурацила на биосинтез флаконы 176 с концентрацией 1,3 х 20 нуклеиновых кислот исследовалось в X 10 и 8,0 X 10 для линий ЕРО и концентрациях 125, 250, 500 и Раушер/МХ соответственно. Исследуе- 1000 мкг/мл. Время контакта клеток с мое соединение I вводят с первой сме- соединением I составляр:т 18 ч. Вклю- нрй среды через 6 ч после посадки кле- чение Н-тимидина и Н-уридина изме- фк в концентрациях 125, 250 и 25 ряется в нмоль/10 клеток. 5:00 мкг/мл. Соединение I присутствует Изучение включения меченых тимиди- в среде постоянно. Для подсчета через на и уридина в клетки показывает, что 24, 72 и 120 ч клетки снимают со стек- соединение I начинает заметно ингиби- ла, используя 0,5%-ный раствор трип- ровать синтез нуклеиновых кислот, на- сина, и суспендируют в 0,4%-ном раст- 30 чиная с концентрации 250 мкг/мл. Ве- воре трипанового синего на 3%-ном личины 50%-.ных ингибирующих концент- хлориде натрия. В камере Горяева под- раций составляют 660 и 760 мкг/ считывают только , неокрашенные /мл для ДНК и РНК соответственно, клетки.Результаты изучения влияния соедиРезультаты изучения цитостатичес - 5 иия I на синтез нуклеиновых кислот кого действия 1-(/1-В-ксилофуранозил)- представлены в табл. 2. -5-трифторметш1урацчла (см. табл. 1)

свидетельствуют, что соединение явля- Результаты изучения антигерпетиче- ется малотоксичным, В исследованном ° активности, цитотоксичности и диапазоне концентраций ингибирование 40 влияния на синтез клеточных макромо- роста клеток, отчетливо выявляется У свидетельствуют о том, что сое- лишь при максимальной из. испытанных динение I является малотоксичным ве- концентраций (500 мкг/мл) на 72 ч рос- ществом, обладающим достоверным и из- та и составляет 56,7 и 39,6% от конт- бирательным антигерпетическим дей- роля для клеток линий VERO и Pay- 45 , поскольку в соответствии с шер/МХ соответственно. К 120 ч рос- известной методикой за токсическую та это различие существенно уменьша- концентрацию принимается та концент- ется (78,6 и 64,4%). Несмотря на от- Р которой синтез клеточной меченное ингибирование роста, харак- Д подавляется на 50%, то возможно тер логарифмической фазы принципиаль-50 терапевтическую широту 1-(- но не изменяется.-0-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацила. ИД по подавлению синтеза ДНК

Изучение влияния соединения I на составляет 660 мкг/мл, а Щ по аи- синтез белка проводят по общепринятой тигерпетической активности.210 мкг/мп, методике, в соответствии с которой „ и следовательно, химиотерапевтический предшественником для синтеза белка индекс равнеЗ,14.

служит С-гидролизат хлореллы. Вре- Известный структурный аналог сое- мя контакта клеток с препаратом сое- динения I - трифтортимидин в отличие тавляет 6 ч. Исслед тот концентрации от него не обладает избирательным антигсрпетическим действием, и его тнгерпетический эффект реализуется в аналогичном тесте при концентрации 0,7 мкг/мл, а подавление синтеза ДНК на 50% при концентрации 0,01 мкг/мл. Величина, соответствующая химиотера- певтическому индексу, для трифторти- мидина равна 0,014, и его антигерпе- тическое действие проявляется в кончто соединение tro изобретению об;га- дает более высоким химиотерапевтичес- ким индексом. Так, для идоксуридина ИД -концентрация препарата, вызывающая 50%-ное подавление репродукиии вируса простого герпеса (ВПГ-1)составляет О, 13 мкг/мл; Hflj(, - ко.нцент- рация препарата, вызывающая 50%-ное подавление синтеза ДНК в клетках

центрациях, в 70 раз превышающих ток-100,25 мкг/мл, и химиотерапевтический

сичные для клеток. Так, трифтортими-индекс равен 0,25/0,,92. Для соедин изменяет клеточную морфологию надинения по изобретению соответствую50% при экспозиции 72 ч и концентра-щие ингибирующие концентрации ЭДуо

ции АО мкг/мл. В аналогичных условиях(ВПГ-1) 210 мкг/мл; ИД j,, . (подавление

для достюкения такого же эффекта под 15синтеза ДНК) 660 мкг/мп, н химиотерадействием соединения I требуется кон-певтический индекс равен 660/210

центрация более 900 мкг/мп.3,14.

Соединение I обладает антигерпетическим действием в отношении щтамма

Таким образом, соединение по изобретению обладает в 1,64 раза (3,14/..

ВПГ-1, дефектного по тимидинкиназе 20 (ТК) в концентрациях, аналогичных для исходного штамма В11Г-1. Вирус простого герпеса (ТКО является резистентным к известному антигерпетическому соединению 9-(2-оксиэтокси- метил)-гуанину(ациклогуанозину).

Обработка вируса простого герпеса 1-(-0-ксш1офуранозил)-5-трифторме- тилурацилом в изученном диапазоне концентраций практически не снижает его инфекционности, что свидетельствует об отсутствии у вещества вгфу- . лицидного действия.

Сравнение активности (1- з-В-ксило- фуранозил-5-трифторметилурацил) с из- 35 вестным аналогом по назначению - антигерпетическим препаратом идоксуриди- ном (KericicJ), 1-(2 -дезокси-/5-В-ри- бофуранозил)-5-иодурацил) показывает.

/t,92 1,64) большей широтой химио- терапевтического действия.

Формула и

зобретения

5 1-(В-В-Ксилофуранозил)-5трифтор- метилурацил формулы

О

30

НО

-0

он

он

обладающий антигерпетической активностью.

Т а б л и ц 9 ,1 .

Цитостатическое действие 1-(;з-П-ксилофуранозил) -5-трифторметилурацшта на культуры клеток VERO и Раушер/МХ

t9498 что соединение tro изобретению об;га- дает более высоким химиотерапевтичес- ким индексом. Так, для идоксуридина ИД -концентрация препарата, вызывающая 50%-ное подавление репродукиии вируса простого герпеса (ВПГ-1)составляет О, 13 мкг/мл; Hflj(, - ко.нцент- рация препарата, вызывающая 50%-ное подавление синтеза ДНК в клетках

Таким образом, соединение по изобретению обладает в 1,64 раза (3,14/..

/t,92 1,64) большей широтой химио- терапевтического действия.

Формула и

зобретения

20

.

5 1-(В-В-Ксилофуранозил)-5метилурацил формулы

О

30

НО

-0

он

он

Таблица2 Влияние 1-((а-П-ксилофуранозил)-5-трифторметипурацила на синтез ДНК и РНК

в клетках VERO

Редактор Л.Герасимова

Составитель В.Волкова

Техред М.Ходанич Корректор Г. Решетник

Заказ 794ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, А

Изобретение касается замещенных фурана, в частности 1-(/5-В-ксипофура- нозил)-5-трифторметилурацила (ФМ), которьй обладает антигерпетической активностью и может быть использован в медицине. Цель - создание более активных веществ этого класса. Синтез ФМ ведут из 5-трифторметилурацила и гексаметилсилазана в присутствии ди- метилдихлорсилана при кипячении с последующей обработкой 1-0-ацотш1-2,3, 5-три-0-бензоил-/}-В-ксилофуранозой в присутствии SnCl. Выход 74,4%. Испытания показывают, что ФМ проявляет антигерпетическую активность в отношении штамма ВПГ-1, дефектного по тимидинкиназе, обладает более высоким химиотерапевтическим индексом, чем чдоксуридин (в 1,64 раза). 2 табл. (Л СО 4 СО 4 О