Способ выделения раковоэмбрионального антигена Советский патент 1992 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к мсяицине.

Целью изобретения янляртся повы)ение выхода целевого продукта за счет умень- июиия этапов выделения до 2-х хроматографии и применения нового, анионообмен- ника.

/7/7«л р..Экстракция ракопозмбрионально- го антигена (РЭЛ) из опухолевой ткани.

1 кг ткани метастазов рака прямой кишки в печень измельчают н гомогенизируют в 2 л 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 м NaCI, при 8000 об/мин в течение 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 9000 g в течение 30 мин. К супернатанту добавляют равный объем 2 М НСЮ, перемепжвают в течение 30 мин при 4°С. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин. Супер- натант нейтрализуют до рН 6,0 1 М NaOH концентрируют ультрафильтрацией на мембранном фильтре «Рипор-1-120 до объема 240 мл и диализируют против дистиллированной в оды (2 смены по 4 л) в течение 12 ч при 4°С, затем против 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,4) (2 смены по 4 л) в течение 12 ч при 4°С. После диализа экстракт центрифугируют при 35000-g в течение 30 мин.

Ио ообменнаяхроматография на

ДЕАЕ 32-целлюлозе: , ..

Полученный экстракт наносят на колонку .3,5X23 см с ДЕАЕ-32 целлюлозой, уравновешенную 0,0 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,02% NaNs. Элюи- рование осуществляют линейным градиен- то.м О-0,2 М N.aCl н этом же буфере. Скорость элюирования 10 мл/ч, объем элюирую- шего буфера 900 мл. Фракции (общий объем 220 мл), содержащие РЭА, после концентрирования ультрафильтрацией до 60 мл диализируют против 0,01 М натрий-фосфатного буфера {рН 7,4) в течение 12 ч при 4°С.

Ионообменная хроматография На АНР-сефарозе.

Объединенную фракцию после хроматографии на ДЕАЕ-32-целлюлозе наносят на колонку 2,2Х 13 см с .АНР-сефарозои, уравновешенную 0,01 АД натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,02% NaNa. Промывают колонку 100 мл стартового буфера со скоростью 10 мл/ч. Элюирование осуществляют лииеппым градиентом О-

0,1 М NaCI в 0,0 Г М натрнй фосфат- ном буфере (рН 7,4), содержащим 0,02% NaNs. Скорость элюирования 10 мл/ч, объем члюирующего буфера 560 мл. Фракции

(общий объем 270 мл), содержащие РЭА, концентрируют ультрафильтрацией до 6 мл. Гель-хроматография на сефадексе Gr200. Объединенную фракцию после хроматографии на АНР-сефярозе наносят на колонку

2,5X78 см с сефадексом G-200, уравновешенную 0,01 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,5 М NaCI и 0,020 NaNs. Элюирование проводят со скоростью 10 мл/ч. Фракции, содержащие РЭА, объединяют, диализируют против дис5 тиллированной воды И лиофилизируют.

Количество выделенного РЭА (концентрацию РЭА определяли с помощь о коммерческого набора СЕАК-Р R фирмы «International CIS) составляет 120 мг или 12% от содержания его в экстракте.

0 Полученный данным способом препарат РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Имму- ноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиспецифической антисывороткой (кроличья антисыворотка к экстракту из опухолевой ткани). При, повторной гель- хроматографии препарата РЭА на сефадексе G-200 получен ..один симметричный пик. Молекулярная масса РЭА, определенная

0 с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 180000 Д:

Формула изобретения

5 Способ выделения раковоэмбриональ- ного антигена путем экстракции опухоле,- вой ткани хлорной кислотой с последую-: щей ионообменной хроматографией экстрак-. та на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматофа- фией на сефадексе G-200, отличающийся тем, что, с целью повыщёния выхода целевого продукта, после хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе дополнительно Провидят хроматографию на аминогидроксипропил-сефарозе с элюцией целевого продукта линейным гра5 диентрм концентрации хлористого натрия 0-0,1 М в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4.

Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения раковоэмбри- онального антигена (РЭА). Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта путем- уменьшения этапов выделения до 2-х хроматографии и применения нового ани- онообменника. Проводят экстрацию РЭА из опухслевой ;гк анй. Ткань метастазов рака прямой кишки в печень гомогенизируют, гомогейат центрифугируют при 9000 g 30 мин. К супернатанту добавляют равный объем 2 М НСЮ, перемешивают 30 мик при 4 С. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g. Супернатант нейтрализу- , ют до рН 6,1 1М NaOH, концентрируют и диализуют. После диализа экстракт центрифугируют при 35000 g 30 мин. Проврдят ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-32 целлюлозе. Затем проводят ионообменную хроматографию на АНР-сефарозе, затем- гель-хроматографию на сефадексе G-200. Полученный препарат РЭА содержит одну белковую полосу при электрофорезе и по- лиакриламиднОм геле в присутствии до- децилсульфата натрия. Иммуноэлектрофорез также дает одну полосу преципитации с полиспецифической антисывороткой. Молекулярная масса РЭА, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 180000 Д. со Oi со ел С5 ю