Способ определения энтеротоксина энтеробактерий в биологическом материале Советский патент 1988 года по МПК C12N1/00 G01N33/48 

со

00 00

ю

11388422

Изобретение относится к медицине, Цель изобретения - повышение точности способа за счет выявления локализации термолабильного энтеротоксина.

Способ осуществляют следующим образом.

Органы, предназначенные для исиследования, режут на кусочки не более 0,5 см и опускают их на 1 ч

в спирт 96 при 4 С, Затем кусочки извлекают и режут острой бритвой на кусочки не более 0,3 мм толщиной и снова опускают для дофиксации во вторую порцию спирта 96 на 24 ч при . Далее их проводят по 1 ч через 2 порции спирта 96 и через 2 порции спирта 100 при 4°С, Затем ткань о брабатывают 2 порциями ксилола по 20 мин каждой при 4 С, Посл этого следует проводка по 1 ч в 3 порциях парафина при 56-58 С, Затем кусочки заключают в парафин. Приготовленные парафиновые блоки хранят при 4 С. Перед исследованием на тер молабильный энтеротоксин из парафиновых блоков готовят срезы толщиной 3-5 мкм. Непосредственно перед окраской срезы депарафинируют при комнатной температуре, для чего- их опускают последовательно в стаканчики с двумя порциями ксилола, затем в спирт-ксилол в соотношении 1:1 на 15-20 мин в каждом стаканчике. Затем проводят по спиртам 100, 96, 70, 50 по 5 мин в каждом и через 4 порции фосфатно-буферной смеси с ,рН 7,2-7,4 по 5 мин в каждой порции Перед началом окраски стекла опуска

0

5

сидазой хрена, Конъюгат используют в рабочем разведении 1.:100 в фосфатном буфере. Контакт осуществляют в течение 60 мин на водяной бане при комнатной температуре. После т рех- кратного отмывания в фосфатном буфере на срезы наносят свежеприготовленный субстрат. Спустя 5 мин срезы

0 отмывают от субстрата дистиллирован-- ной водой и контрастируют 0,2-ным раствором четырехокиси осмия под контролем микроскопа. Срезы можно докрасить гематоксилином. Антиген,

5 термолабильньм энтеротоксин энтеро- бактерий, выявляется на срезах в виде бурых гранул и пятен различного размера.

Способ подтверждается примером. Пример, Мы1чей в возрасте 2-2,5 мес заражают перорально суточной культурой кишечной палочки штамма Н-10407, В различные сроки после заражения (3,6,8,14, 18 и 24 ч) их умерщвляют, берут кусочки тканей из тощей, подвздошной и прямой кишки, фиксируют в нейтральном формалине и заливают в парафин, как описано . После контакта исследуемой ткани с фракцией иммуноглобулинов Igg

0

иммунной сыворотки кролика против

термолабильного энтеротоксина кишечной палочки,соединенной с перокси- дазой хрена, и контрастирования 0,2%-ным раствором четырехокиси осмия в исследуемых срезах выявляют антиген, термолабильный знтеротоксин кишечной палочки. Он локализовался на поверхности ворсинок.

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение точности способа путем выявления локализации термолабильного энтеротоксина. Для этого готовят гистологические срезы, затем инкубируют их с фракцией иммуноглобулинов Igg антиэнтеротоксичес- кой сьшоротки, соединенной с перокси- дазой хрена, после чего наносят диа- минобензидин, контрастируют четырех- окисью осмия. Энтеротоксин фиксируют в местах появления окрашивания. Антиген, термолабильньш энтероток- син энтеробактерий, выявляется на срезах бурыми гранулами и пятнами различной величины. § (Л

на 5-10 мин в фосфатно-солевой буфер с рН 7,2-7,4 при комнатной температуре.

После депарафинирования для связывания энедогенной пероксидазы срезы помещают на 30 мин в раствор перо ксидазы хрена, приготовленный из . расчета 15 мг препарата на 10 мл фосфатно-буферной смеси при рН 7,2- 7,4, После трехфазного отмывания в фосфатном буфере срезы обрабатывают перекисью водорода на метаноле в соотношении 1:99 в течение 10 мин. После очередного трехкратного отмывания в фосфатном буфере на испытуемые срезы наносят конъюгат, представ ляющий собой фракцию иммуноглобулино иммунной сыворотки кролика против термолабильного энтеротоксина кишечных палочек, соединенную с перок

Способ позволяет определить точную локализацию энтеротоксина знте- робактерий.

Формула изобретения

СпЪсоб определения энтеротоксина энтеробактерий в биологическом материале, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет выявления локализации термолабильного энтеротоксина, готовят гистологические срезы, инкубируют с фракцией иммуноглобулинов Igg антиэн- теротоксической сыЪоротки,соединенной с пероксидазой хрена, после чего наносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия и определяют знтеротоксин в местах мояв.чения окрашивания .