(21)4078819/31-13
(22)19.06.86
(46) 15.04.88. Бюл. № 14
(71)Физико-химический институт им. А.В.Богатского и Институт микробиологии АН СССР
(72)Н.П.Милиенко, Т.И.Давиденко и В.Д.Кузнецов
(53) 547.824.07(088.8) (56) Патент США № 3453179, кл. 195-51, 1969.
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-БРОМ-5-(о-, т-,п-ХЛОР)ФЕНШ1-3-МЕТИЛ-1,2-ДИГИДРО- -ЗН-1,4-БЕНЗДИАЗЕПИН-2-ОНОВ (57) Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается получения биологически активных веществ. Целью изобретения является повьппение выхода и оптической . чистоты целевого продукта. Способ предусматривает культивирование клеток Streptomyces roseochromogenes ВКМ А-612 в водной питательной среде и инкубирование при рН 6,5-7,5 в течение 18-24 ч с последующим выделением целевого продукта. 1 табл.
00 О) 00
li
113
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биологически активных соединений.
Цель изобретения - повьшение выхода и оптической чистоты целевого продукта.
Способ заключается в том, что клетки Streptomyces roseochromogenes ВКМ А-612 культивируют в питательной среде, содержащей, г/100 мл кукурузный экстракт 1,- глюкозу 0,5; (NH4)iS04 0,35; СаСО, 0,5; крахмал 1,5; NaCl 0,5, при рН 6,5-7,5, затем ВНОСЯТ 7-бром-5-(о-,м-,п-хлор)фе- нип-1,3-диметил-1,2-дигидро-ЗН-1,4- -бенздиазепин-2-он, инкубируют в течение 18-24 ч при 28-30 С с последующим выделением целевого продукта путем экстракции хлороформом и перекристаллизацией из спирта. .
Культура Streptomyces roseochromogenes ВКМ А-612 депонирована во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР.
Способ позволяет получить оптически активные 7-бром-5-(о-,м-,п-хлор)- фенил-З-метил-1,2-дигидро-ЗН-1,4- -бенздиазепин-2-оны в качестве-единственного продукта с выходом 45-48% или, учитывая образование оптически активного продукта, 90-96%.
Установлена высокая избирательность к реакциям N-деметилирования 1,4-бенздиазепин-2-онов штамма Streptomyces roseachromogenes ВКМ А-612, так как проверка в плане N- -деметилирования 154-бенздиазепин-2- -онов других штаммов: Streptoverti- cillium cinamoneum ВКМ А-608 и Streptomyces viridis, ВКМ А-607 не приводит к положительным результатам, выходы деметилированнык 1,4-бенздиазе- ШШ-2-ОНОВ не превьш1ают 10-12%.
На примере N-деметилирования 7- -бром-5-(о-хлор)фенил-1,3-диметил- -1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- -она показано, что наиболее оптимальным временем инкубации является 18- 24 ч, что при инкубации в течение 12 ч продукт N-деметилирования образуется всего лишь с 41,7% выходом от максимального, при увеличении времени инкубации наблюдается побочное образование 3-оксипроизводных 1,4- -бенздиазепин-2-онов, что затрудняет выделение целевого продукта.
Влияние времени инкубации на выход 7-бром-5-(о-хлор)фенил-3-метил- -1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- -она приведено ниже.
ремя инкуации, ч
6
12
18
24
30
36
Выход 7-б ром-5- -(о-хлор)фенил- -З-метил-1,2- -дигидро-ЗН- -1,4-бензди- азепин-2-она, % от максимального
37,5 41,7 95,8
1ио,о
100,0 100,0
При времени инкубации 30 и 36 ч наблюдалось образование 3-оксипроиз- водного,
3Q Влияние рН среды инкубации на выход 7-бром-5-(о-хлор)фенил-3-метил- -1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- -она приведено ниже:
5
0
рН среды инкубации
5
Q
5
5,0 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 9,0 10,0
Выход 7-бром- -5-(о-хлор)фе- нил-3-метил- -1,2-дигидро- -ЗН-1,4-бенз- диазепин-2-она, % от максимального
60
85 100 100 100
92
71
52
Приведенные данные подтверждающие, что при рН 6,5-7,5, выходы 7-бром-5(о-хлор)фенил-3-метил-1,2-дигидро- Н-1,4-бенздиазепин-2-онов максиальны.
Влияние температуры инкубации на ход 7-бром-5-(о-хлор)фенил-3-ме- л-1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенздиазепин- 2-она приведено ниже:
Температура инкубации, С
24 26 28 30 32 37 40
Выход 7-бром- -5-(о-хлор)- фeнил-3-мeтил- -1,2-дигидро- -ЗН-1,4-бенз- диазепин-2- -она, % от максимального
63
89 100 100
91 72
51
Выход 7-бром-5-(о-хлор)фенил-3- -метил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазе- пин-2-она максимален при 28-30 С.
Состав среды оптимизируют методом математического планирования по плану полного факторного эксперимента ПФЭ-23. Способ получения 7-бром-5- /Ь-,м-,п-хлор)фенил-3-метил-1,2-ди- гидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-онов осуществляют следующим образом. 2- недельную культуру Streptomyces го- seochromogenes ВКМ А-612, выращенную на агаризованной овсяной среде, переносят в пробирки с 10 мл среды следующего состава, г/100 мл воды: кукурузный экстракт 0,5, крахмал 0,75; (NK4)tSO 0,175; NaCl 0,25 0,25; глюкоза 0,25, инкубируют на встряхивателе 2 сут при 28 - 30 С и скорости вращения качалки 220 об/мин. Посевной материал переносят в колбы объемом 750 мл со 100 мл среды состава, г/100 мл: кукурузный экстракт 1, глюкоза 0,5, (Ш) 30 0,35 СаСО, 0,5, крахмал 1,5J NaCl 0,5, инкубируют еще 2 сут Затем в колбы вносят 7-бром-5-(о-, м-,п-хлор)фенил-1,3-диметил-1,2-ди
0
5
0
5
0
5
0
5
5
0
гидро-ЗК-1,4-бенздиазепин-2-он в диметилсульфоксиде и после 18-24 ч инкубации экстрагируют хлороформом. Получают 7-бром-5-(о-,м-,п-хлор)фе- нил-З-метил-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенз- Диазепин-2-он. Продукты очищают перекристаллизацией из спирта..
Пример 1. 2-недельную культуру Streptomyces roseochromogenes ВКМ А-612, выращенную на агаризованной овсяной среде, переносят в 20 пробирок, содержащих по 10 мл среды состава, г/100 мл: кукурузньт экст- ракт- 0,5, NaCl 0,25 (га4)г50-4 0,175, СаСО 0,25, глюкоза 0,25, крахмал 0,75, и инкубируют 2 сут при 30 С на встряхивателе со скоростью вращения 220 об/мин. Содержимое пробирок переносят в 20 колб Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 100 мл среды следующего состава, г/100 мл: кукурузный экстракт 1 NaCl 0,5; (NH4)a S04 0,35; CaCQ, 0,5; глюкоза 0,5; крахмал 1,5, и инкубируют в тех же условиях еще 2 сут. Затем в каждую колбу вносят по 3 мг 7-бром- -5-(о-хлор)фенил-1,З-диметил-1,2-ди- гидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она в диметилсульфоксиде и продолжают ин- кубаимю при 30°С, рН 7,0 в течение 24 ч. Содержимое колб экстрагируют хлороформом, растворитель упаривают в вакууме. Остаток очищают перекристаллизацией из спирта, получают 27,7 мг 7-бром-5-(о-хлор)фенил-3-ме- тил-1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенздиазепин- -2-она, продукт оптически активен, +96°, 230 нм. Т.пл. 243-245°С, выход 48%, а если учитывать образование оптически активного продукта 96%.
Найдено, %: С 32,6; Н 3,1; N 7,6.
CigH BrClNjO
Вычислено, %: С 52,9, Н 3,3, N7,7.
Согласно данным масс-спектров МБ 363.
Пример 2. Порядок вь1полне- ния операций аналогичен примеру 1, время инкубации 18 ч.
Пример 3. Порядок выполнения о:1ераций аналогичен примеру 1 . Пример иллюстрирует нецелесообразность вьтолнения предлагаемого способа при времени инкубации 12 ч. Больше 24 ч инкубацию производить нецелесообразно, так как при этом наблюдается образование 3-оксипроиз- вo fнoгo.
513
Пример А. Порядок выполнени операций аналогичен примеру 1. Только используется 7-бром-5-(м-хлор)фе- нил-1,3-диметил-1,2-дигидро-ЗН-1,4- -бенздиазепин 2-он, выход 7-бром-5- -(м-хлор)фенил-3-метил-1,2-дигидро- -ЗИ-1,4-бенздиазепин-2-она 46%, (если учитывать образование оптически активного продукта 92%) .
Найдено, %: С 52,5; Н 3,0 N 7,4.
С,,Н,г BrClN O
Вычислено, %: С 52,9, Н 3,3; N 7,7,
Согласно данным масс-спектров МБ 363.
Пример 5. Порядок выполнени операций аналогичен примеру 1, толь
-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- оныв качестве единственного продукта, тогда как в прототипе образуются еще 3- оксипроизводное 1,4-бенздиазепин-2ко время инкубации 18 ч.
Пример 6. Порядок выполнения 2о получать оптически активные операций аналогичен примеру 1, толь- 7-бром-5-(о-,м-,п-хлор)фенил-3-метил-1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенздиазе- ПИН-2-ОНЫ, для 7-бром-5-(о-хлор)фе- нш1-3-метил-1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенз- 25 диазепин-2-она oi j, +96 .
Результаты N-деметилирование 7- -бром-5-(о-,м-,п-хлор)фенил-1,3-ди-. метил-1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенздиазеко время инкубации 12 ч. Пример иллюстрирует нецелесообразность выполнения данного способа при этом времени инкубации.
Больше 24 ч инкубацию проводить нецелесообразно, так как при этом наблюдается образование 3-оксипроизводного.
Пример 7. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1,только используется 7-бром-5-(п-хлор)фе- нил-1,3-диметил-1,2-дигидро-ЗН-1,4- -бенздиазепин 2-он, выход 7-бром-5- -(п-хлор)фенил-3-метил-1,2-дигидроПИН-2-ОНОВ по примерам 1-9 приведены в таблице.
Фо.рмула изобретения Способ-получения 7-бром-5-(о-,м-, п-хлор)фенил-З-метил-1,2-дигидро-ЗН- -1,4-бенздиазепин-2-онов, предусматривающий культивирование микроорга-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она 45%, если 35 ниэма-биотрансформатора в водной пи- учитывать образование оптически активного продукта 90%,
Найдено, %: С 52,6; Н 3,2; N 7,5,
CigH iBrClN O
Вычислено, %: С 52,9, Н3,3, N 7,7.
Согласно данным масс-спектра МБ 363.
40
тательной среде, содержащей кукурузный экстракт, углевод и факторы роста, инкубирование до максимального накопления целевого продукта в присутствии Ы-метилпроизводного-1,2-ди- гидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она с последующим вьщелением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения выхода и оптательной среде, содержащей кукурузный экстракт, углевод и факторы роста, инкубирование до максимального накопления целевого продукта в присутствии Ы-метилпроизводного-1,2-ди- гидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она с последующим вьщелением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения выхода и опПример 8. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1, толь- тической чистоты целевого продукта, ко время.инкубации 18 ч.в качестве биотрансформатора испольПример 9. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1, тользуют штамм актиномицета Streptomyces roseochromogenes ВКМА-612,культивирование ведут в питательной среде
ко время инкубации 12ч. Пример иллюстрирует нецелесообразность выпол- 50 содержащей в качестве углевода - глюкозу в количестве 5 г/л воды, а инкубирование ведут при рН 6,5-7,5.
нения данного способа мени инкубации.
при этом вреБольше 24 ч инкубацию производить нецелесообразно, так как при этом наблюдается образование 3-оксипроиз- водного.
Таким образом, предлагаемый способ получения оптически активных 7-, -бром-5-(о-,м-,п-хлор)фенил-3-метил- -1,2-ДИГИДРО-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- -онов по сравнению с прототипом позволяет повысить выход 7-бром-5-(о-, М-,п-хлор)фенил-З-метил-1,2-дигидро- -ЗН-1,4-бенздиазепин-2-онов с 10- 11% в прототипе до 45-48%, получить f. 7-бром-5-(о-,м-,п-хлор)фенил-3-метил
-1,2-дигидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2- оныв качестве единственного продукта, тогда как в прототипе образуются еще 3- оксипроизводное 1,4-бенздиазепин-2ПИН-2-ОНОВ по примерам 1-9 приведены в таблице.
Фо.рмула изобретения Способ-получения 7-бром-5-(о-,м-, п-хлор)фенил-З-метил-1,2-дигидро-ЗН- -1,4-бенздиазепин-2-онов, предусматривающий культивирование микроорганиэма-биотрансформатора в водной пи-
тательной среде, содержащей кукурузный экстракт, углевод и факторы роста, инкубирование до максимального накопления целевого продукта в присутствии Ы-метилпроизводного-1,2-ди- гидро-ЗН-1,4-бенздиазепин-2-она с последующим вьщелением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения выхода и оптической чистоты целевого продукта, в качестве биотрансформатора используют штамм актиномицета Streptomyces roseochromogenes ВКМА-612,культивирование ведут в питательной среде.
содержащей в качестве углевода - глюкозу в количестве 5 г/л воды, а инкубирование ведут при рН 6,5-7,5.
