Бромид 3-аллил-5-анилинометилен-4-оксо-2-(2-карбоксиэтилтио)-4,5-дигидротиазолия, проявляющий антипротеолитическую активность Советский патент 1990 года по МПК C07D277/36 A61K31/14 A61K31/426 A61P7/04 

(46) 07.05.90. Бюл. № 17

(21)4113276/31-04

(22)25.08.86

(71)Институт органической химии АН УССР

(72)Н.Н. Романов, С.Е. Могилевич, Е.К. Микитенко и В,М. Клебанов

(53)547.789.3.03(088.8)

(56) Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1984, ч. 2, с. 73.

Авторское свидетельство СССР 1334670, кл. С 07 D 277/36, 1985 (непубликуемое).

(54)БРОМИД 3-АЛПШ1-5-АНИЛИНОМЕТИЛЕН- -4-ОКСО-2-(2-КАРБОКСИЭТШГГИО)г4,5- ДИГИДРОТИАЗОЛИЯ, ПРОЯВЛЯЩИЙ АНТИПРО- ТЕОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

(57) Изобретение касается замещенных гетероциклических веществ, в частности бромида З-аллил-5-анилинометилен- -4-ОКСО-2-(2-карбоксизтилтио)-4,5-ди- гидротиазолия (ГТ), который проявляет антипротеолитическую активность и может быть использован в медицине. Цель - создание более активных веществ указанного класса. Синтез ГТ ведут нагреванием бромпропионовой кислоты и З-аллил-5-анилинометилеи- роданина при 120 с. Выход ГТ 85%, брутто-ф-ла С Н, BrNjOjSj. Токсич-- ность LDj(,i300 мг/кг, ГТ подавляет казеинолитическуго активность трипси-. на и химтрипсина в степени большей, чем амбен и аналоги. 1 табл.

сл

DO

(Х N

Ob

1

О5

1139А676

Изобретение относится к новым биологически активным химическим соединениям, а именно к бромиду 3-аллил- -5-анш1инометилен-4 оксо-2-(2-карбок- сиэтилтио)-А,5-дигидротиазолия, проявляющему антипротеолитическую активность.

Указанное свойство предполагает

возможность применения этого Соедине- ю помощью 0,1 и. NaOH (контроль величи- ния 6 качестве ингибитора протеолити- ны рН проводили на рН-метре со .стек- ческих ферментов в медицине.

Целью изобретения является усиление антИпротеолитической активности

15

лянным электродом) и доведением объ- . ема до 100 мл.

Инкубацию проводили в течение 15 мин при 37°С на водяной бане со встряхивателем. По оконч. нии инкубации реакцию останавливали добавлением 2 мл 5%-ной трихлорУ ссусной кислоты. Через 1-1,5 ч после окончания реакции

ленроданина, 1,5 г бромпропионовой кислоты нагревают при 120 С 2 ч. Посв ряду производных тиазола.

Пример. Получение бромида 3-аллил-5-анилинометилен-4-оксо-2- -(2-карбоксиэтш1тио)-4,5-дигидротиазолия (соединение I).

Смесь 2,8 г 3-аллил-5-анилин6мети- 20 осадок белка отделяли центрифугированием при 1000 g в течение 15 мин и измеряли оптическую плотность надо- ле охлаждения плав растирают с ацето- садочной жидкости на спектрофотометре ном, продукт отфильтровьгаают, полу- СФ-4А при длине волны 280 нм против чают 3,5 г (85%) соединения 1, paS- 25 лагающегося при нагревании выше 150 С.

Найдено, %: С 45,0; Н 4,0; Вг , 18,5; N 5,9; S 15,0.

Crt Н„ .

Вычислено, %: С 44,76; Н 3,96; 30 Вг 18,65; N 6,53; S 14,92.

Определение токсичности соединения 1.

Проводили в опытах на белых беспородных мышах (10 штук) массой 18-20 r.js пробирку вносили 0,10 мл (0,25, Суспензию вещества в водном растворе 0,5, 1,0, 1,5 мл соответственно) рас- крахмала вводили внутрижелУдочно че- твора вещества (100 мкг/мп) в 0,05 М

контроля, который обрабатывали сходным образом, но 0,5 мл трипсина вносили после добавления трихлоруксусной кислоты.

Полученное значение экстинкции Е использовали для вычисления ингиби- рующей активности испытуемого вещества.

При определении ингибирующей активности испытуемого вещества в опытфосфатном буфере (рН 7,6) и тот же буфер до общего объема 1,5 мл, добав- 4Q ляли 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание белка 14 мкг/мл). Далее пробы обрабатывали так же, как н в случае определения казеинолити- ческой активности трипсина. Контроль

рез зонд из расчета 300 мг на 1 кг живой массы тела. Наблюдение проводили в течение 2 сут после введения, Результаты наблюдения показали, чта летальный исход не наблюдается ни у одного из экспериментальных животных. Из этого следует, что величина

фосфатном буфере (рН 7,6) и тот же буфер до общего объема 1,5 мл, добав- 4Q ляли 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание белка 14 мкг/мл). Далее пробы обрабатывали так же, как н в случае определения казеинолити- ческой активности трипсина. Контроль

LDjv, соединения 1 превышает ЗООмг/кг.45 содержал те же составляющие, но трипсин вносили после добавления трихлоруксусной кислоты.

псин вносили после добав хлоруксусной кислоты.

Степень ингибйровани формуле

Изучение антипротеолитИческой активности.

Изучали в-опытах in vitro методом измерения степени торможения реакции

гидролитического расщепления казеина, 50 Степень ингибйрования катализируемой трипсином или химо- i трипсином.где

Для определения казеинолитической активности трипсина использовали метод К.Н. Верамеенко.55

В пробирку на 20 мл добавляли 1,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6) и 0,5 мл раствора трипсина в том . же буфере (содержание белка 14 мкг/мл)

Е и Е - оптическая присутстви вещества и ответстве

Определение казеиноли тивности кимотрипсина п той же схеме, что и для вместо трипсина вносили

и проводили преинкубацию в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 1,0 мл 2%-ного раствора казеина по Гаммерстену в 0,05 М фосфатном б уфере при нагревании на водяной бане .при 70-80 С в течение 30 мин с последующим охлаждением, доведением рН раствора до значения 7,6 с

помощью 0,1 и. NaOH (контроль величи- ны рН проводили на рН-метре со .стек-

лянным электродом) и доведением объ- . ема до 100 мл.

Инкубацию проводили в течение 15 мин при 37°С на водяной бане со встряхивателем. По оконч. нии инкубации реакцию останавливали добавлением 2 мл 5%-ной трихлорУ ссусной кислоты. Через 1-1,5 ч после окончания реакции

осадок белка отделяли центрифугированием при 1000 g в течение 15 мин и измеряли оптическую плотность надо- садочной жидкости на спектрофотометре СФ-4А при длине волны 280 нм против

пробирку вносили 0,10 мл (0,25, 0,5, 1,0, 1,5 мл соответственно) рас- твора вещества (100 мкг/мп) в 0,05 М

контроля, который обрабатывали сходным образом, но 0,5 мл трипсина вносили после добавления трихлоруксусной кислоты.

Полученное значение экстинкции Е использовали для вычисления ингиби- рующей активности испытуемого вещества.

При определении ингибирующей активности испытуемого вещества в опыт пробирку вносили 0,10 мл (0,25, 0,5, 1,0, 1,5 мл соответственно) рас- твора вещества (100 мкг/мп) в 0,05 М

фосфатном буфере (рН 7,6) и тот же буфер до общего объема 1,5 мл, добав- ляли 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание белка 14 мкг/мл). Далее пробы обрабатывали так же, как н в случае определения казеинолити- ческой активности трипсина. Контроль

содержал те же составляющие, но трипсин вносили после добавления трихлоруксусной кислоты.

Степень ингибйрования вычисляли по формуле

(1-Е.)

Степень ингибйрования i где

400Z,

Степень ингибйрования i где

Е и Е - оптическая плотность в присутствии испытуемого вещества и без него соответственно.

Определение казеинолитической активности кимотрипсина проводили по той же схеме, что и для трипсина, но вместо трипсина вносили 0,5 мл химоI3

трипсина (14 мкг белка в 1 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,6).

Сравнивали по активности соединение 1 с аналогом по действию, в ка- честве которого выбран амбен (п-ами- нометилбензойиая кислота) - препарат, применяемый в медицинской практике как антипротеазное средство,.а также с аналогами по структуре - бромидом и хлоридом 4,5-дигидро-2-карбоксиме- тилтио-5-анш1ииометилен-3-аплилтиазо- лия (соединения 2 и 3 соответственно) . При определении антипротеолити- ческой активности соединений кон- центрация амбена во вносимом растворе составляла 3 мг/мл, а производных тиазола - 1 мг/мл.

В качестве величины, характеризующей ингибиторные свойства веществ и позволяющей сравнить эти свойства у разных веществ, выбрана величина ECjQ, т.е. концентрация вещества, для которой степень ингибирования, рассчитаииая по приведенной выше форму- 25 гидротиазолия формулы

ле, составляет 50%. Полученные данные представлены в таблице.

Как видно из представленных в таблице данных, соединение I подавляет казеинолитическую активность трипсина и химотрипсина в значительно большей степени чем аналоги. Так, величина

Антипротеолитическа ния 1 и аналогов по

7,3( 8,0) 4,7(4,6; 4,8)

0,66(0,64; 0,68)

0,59(0,57; 0,61)

0,46(0,40; 0,50 . 0,72(0,063; 0,080)

A676 ЕС

сю 15

20

уд соединения 1 в реакции трипсин V казеин меньше таковой для амбена в 112 раз, соединений 2 и 3 в 10 я 7 раз соответственно.

В реакции химотрипсин - казеии величина ECfy соединения 1 меньше аналогичной характеристики амбенаболее чем в 700 раз, а соединений 2 и 3 - в 91. и II раз соответственно.

Таким образом, антипротеолитичес кая активность соединения 1 значительно вьтае, чем у его структурных аналогов и базового объекта, что указывает на возможность его применения в медицинской практике значительно . меньших дозировках, т.е. при использовании снижается вероятность побоч- ных л})фектов.

Формула изобретения

, .

Бромид З-аллил-5-анилииометилен- . -4-оксо-2-(2-карбоксиэтилтио)-4,5-диСбН5Ш-СН,.5

1©1 0 / SCH2CH COOH

Ои. 1

СН2СН СН2

проявляющий антипротеолитическую тивность.

0,59(0,57; 0,61)