Способ качественного обнаружения трипсина Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

100

IN9

ИзЬбретение относится к производству эндокрионно-фёрментных препаратов и может быть использовано при качественном обнаружении трипсина.

Цель.изобретения - ускорение процесса. :

На фиг. 1-7 приведены зависимости поясняющие предлагаемый способ.

Способ заключается в том, что раствор трипсина нагревают в.присутствии гидроксида калия при 100°С в течение 1 мин. После охлаждения и добавления растворов парафениленди- амина и железоаммониевых квасцов воз никает красно-фиолетовое окрашивание

Возникновение фиолетового окрапм- Вс1Ния связано с образованием основного тиазикового красителя - окисленной формы 3,7-диаминопроизводного (фиолетового Лаута). Синтез красителя, индуцируемый окислительным каталитическим действием иоков трехва- : лентного железа, осуществляется с участием парафенилендиамина и серо- водорода, отщепляемого из трипсина в процессе его щелочного гидролиза.

Структура хромофора, которая может быть представлена в виде двух мезомерно-стабилизированных предель- ных формул - орто- и паразиноидной - приведена в суммарном уравнении синтеза красителя:

2,

.(Г«

HiH

,8 « 6Р

г .YS ryV 1

|н,м-У-3 1 Н, . ,

Ортохиноидная Парахиноидная Фиолетовое Лаута

Образовавшийся краситель имеет

максимум поглощения при 600 нм (фиг, 1, кривая а). Из фиг, 2 и 3 следует, что нагревание раствора, содержащего 0,05 мг/мл трипсина, при ЮО С (фиг. 2) в течение 1 мин (фиг. З) в присутствии 1 мл 50%-ного раствора гидроксида калия способствует максимальному разрыву дисуль(})ид- ных связей ,в его молекуле с образованием сульфида, который при взаимодействий с парафенилендиамином в присутствии железоаммониевых квасцов приводит к синтезу фиолетового Лаута (фиг, 1, кривая б).

д 5

0 5

Q

5

0

с

0

5

Из фиг, 4 и 5 видно, что нагревание раствора трипсина в присутствии 1 мл 50%-ного раствора гидроксида калия способствует достижению цели. При добавлении к гидролизуемым растворам трипсина 1 мл раствора парафенилендиамина (этот раствор приготовлен растворением 0,5 г порошка парафени- лендиамина в смеси 50 мл воды и 100 мл концентрированной серной кислоты) и 1 мл 5%-ного раствора железо- аммониевых квасцов получаются стабильно окрашенные растворы красно-фиолетового цвета (фиг, 6 и 7),

Способ обнаружения трипсина заключается в том, что в колбу на 25 ил помеи1ают раствор 0,05 г трипсина; в 1 мл воды, туда тке добавляют 1 мп 50%-ного раствора гидроксида калия и нагревают в течение 1 мин при , В охлажденную смесь добавляют 1 мл раствора 0,5 г парафенилендиамина в смеси 50 МП воды и 100 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл 5%-ного раствора железоаммониевых квасцов. Затем раствор доводят водой до метки, возникает красно-фиолетовая окраска. Предел обнаружения: 0,01 мг трипсина.

Пример 1. В колбу на 25 мл помещают 0,05 г трипсина в 1 мп воды, далее нагревают щелочью, добавляют О,5 мл раствора парафенилендиамина, 1 мл 5%-ного раствора железоаммониевых квасцов. Объем раствора-доводят водой до метки; возникает слабая красно-фиолетовая окраска. Это объясняется малым количеством добавляемого раствора парафенилендиамина,

Примеры 2 и 3, В колбу на 25 мл помещают раствор 0,05 f трипсина в 1 мл воды, далее раствор нагревают щелочью, добавляют 1 мл или 1,5 мл раствора парафенилеидиами- на, 1 МП 5%-ного раствора железоаммониевых квасцов. Объем раствора доводят водой до метки; возникает красно- фиолетовая окраска. Оптические плотности растворов с добавками 1 мп или 1,5 МП раствора парафенилендиамина имеют одинаковое значение.

Формула изобретения

Способ качественного обнаружения трипсина, предусматривающий приготовление исследуемой пробы фермента, термическзпо обработку и оценку результатов взаимодействия, .отличающийся тем, что, с целью

ускорения процесса, в исследуемую пробу вводят 50%-ный раствор гидрок- сида калия, термическую обработку ведут на водяной бане при в течение Гмин, полученную смесь охлажда1409932

ют, добавляют растворы парафениленг- диамина и ркелезоаммониевых квасцов, а оценку результатов ведут по изменению окраски до появления красно-фиоп летового окрашивания.

Изобретение относится к области производства эндокринногферментных препаратов и может быть использовано при качественном обнаружении трипси-;:. на. Цель изобретения - /;ускорение процесса. Обнаружение трипсина прово- дят путем нагревания раствора испытуемого образца в присутствии 50%-но- го раствора гидроксида калия, а затем в реакционную массу добавляют растворы парафенилендиамина и железо- аммониевых квасцов. 7 ИЛ.

12 1.0

660

700

If.

MM

Фиг. f

Фиг. г

ВО JOO т

Tet nepami/ptf, V

10

w

ФигЛ

0 6ff времй, rtVf.

ueJ

0.50.75

иг.5

A t2

J.1

f.o

0.9

0,S0.5

Фив.6

/) 600 нм

to125.мл

50% ttoH

600 Hi

O.757.O

Pac/rrSop Г7орафемц/тен иоми с1 и/л

12 t1

.50,75r.O M/1

Фиг. 7 V / /W4t/S)y