Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы SaU 6782 Советский патент 1993 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии и касается способа получения рестриктирующей эндонуклеазы (R) Sau 6782, которая может быть использована в молекулярно-биологических и генетических экспериментах по изучению структуры и функций ДНК. а также в генной

инженерии для конструктирования реком- бинантных молекул.

Целью изобретения является упрощение способа, сокращение продолжительности процесса и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения рестриктазы Sau 6782 катионообменную хромэтографию на фос- фоцеллюлозе РИ осуществляют непосредственно после высаливания белков с использованием двойного комбинированного градиента повышающейся концентрации хлористого натрия от 0,0 до 1,0 М и снижающихся значений рИ от 9 до 6.

За единицу активности препаратов рестриктазы принимают количество мкл фермента, вызывающих полный гидролиз 1 мкг ДНК фага Аза 1 ч инкубации при 37°С.

Реакцию рестрикций проводят в инкубационной смеси объемом 30 мкл следующего состава: 0,06 М трис-HCI рН 7,5, 0,015 М MgCi2 0,06 М NaCI, 7мМ / -меркаптоэта- нола, 1 ЕД рестриктазы, 1 м кгДНКфагаА,

Рестриктазную активность тестируют при горизонтальном электрофорезе в 1 % агарозном геле. Гель окрашивают раствором этидия бромида в концентрации 3 м кг/мл 20 мин и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нМ с красным светофильтром..

Удельная- активность выражается в единицах активности на 1 мг белка. Концентрацию белка определяют спектррфото- метричееки.

Примеры конкретного осуществления способа.

Приме р 1. Клетки S/aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптическогогид- ролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифугированием. Бактериальную массу суспендируют в рабочем буфере (РБ) рН 7,4, содержащем 10 мМ К-фосфат, 7 мМ Р -мёркаптоэтанол и 1 м М ЭДТА, добавляют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20°С, Полученную клеточную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс. g 1 ч.Надйсадочная жидкость представляет, собой грубый экстракт. Освобождение от нуклеиновых кислот осуществляют с помощью сульфата стрептомицина. Высалива- н ие белков проводят сульфатом аммония (СА) 80% насыщения. Осадок растворяют в РБ рН 9 до конечной концентрации 2 мг/мл, диалйзуют от СА и наносят на колонку 1,2x10 см с ФЦ, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10мл/ч. Колонку промывают тремя объемами РБ и элюируют фермент двойным комбинированным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0,0 до .1,0 М и снижающихся значений рН от 9 до 6. Объем градиента 80 мл, собираемой фракции 4 мл. Рестриктаза

элюируется узким пиком в области 0,4-0.45 М NaCI, а неспецифические нуклеазы - близкими концентрациями NaCI 0,45-0,55 М (фиг. 1, пример 1),

5Полученный препарат R Sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических : примесей. Выход фермента составляет 1300 ЕД из 1 г биомассы. Активность - 250 ЕД/мл. Удельная активность

0 60000 ед/мг.

П р и ме р 2. Культивирование клеток, их разрушение, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот и высаливание белков ведут, как в примере 1.

5 Осадок растворяют в рабочем буфере рН 8 до конечной концентрации 2 мг/мл, диализуют против РБ и наносят на колонку 1,2x10 см с ФЦ, уравновешенную тем же буфером СО скоростью 10. мл/ч. Колонку промывают

0 тремя объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 Ми снижающихся значений рН от 8 до 7. При этих условиях рестрикта за элюи5 - руется 0x4-0,5 М NaCI и отделяется от неспецифических нуклеаз, обнаруживаемых в зоне 0,55-0,65 М NaGI с хорошим разрешением. :: : ;.. ..- / -.;..- ;. ; Полученный таким способом препарат

0- R Sau 6782 полностью свободен от неспецифических примесей И пригоден для любых видов структурных исследований. Выход фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы. Удельнаяактивность 70000 ЕД/мг. Активность

5 3000 ЕД/мл. ;::

Пример 3. Все этапы вплоть до хроматографической очистки, как в примере

1. Ферменты элюируют градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0,0 до 1,0

0 Ми понижающихся значений рН от 7,5 до 7. При этих условиях рестриктаза элюируется 0,40-0.55 М NaCI, а неспецифические нуклеазы - 0,50-0,65 М NaCI. Следовательно, в условиях более пологого градиента пики

5 оказываются размытыми и эффективного разделения ферментов не происходит. В

препарате R Sau 6782 содержатся примеси нуклеаз. Выход фермента 1200 ед/г. Активность 2000 ёд/мл. Удельная активность 0 55000 ед/мг.

Для стандартной процедуры выделения фермента был выбран пример 2.

Доказательства высокой степени чистоты ферментного препарата получены при 5 использовании современных тестов (фиг.2). Тестирование экзонуклеазных примесей осуществлялось по степени лигирова- ния фрагментов рестрикции. Полученные в результате гидролиза A Sau 6782 фрагменты ДНК фага Алигировались ДНК-лйгазой фага Т4 с эффективностью более 90%. Однако абсолютные доказательства отсутствия следовых количеств экзонуклеаз в препарате R Sau 6782 получены при инкубации 14-член- ного синтетического меченого 32Р олиго- нуклеотида (ОНД), не имеющего сайта узнавания для исследуемого фермента, с R Sau 6782. При инкубации ОНД с R в течение 18 ч на радиоавтограмме была получена лишь исходная полоса, что свидетельствует об исчерпывающем освобождении фермента от сопутствующих экзонуклеаз.

Тестирование неспецифических эндо- нуклеазных примесей проводили путём длительной в течение 36 ч инкубации ДНК фага Я с избытком ферментного препарата. Различий со стандартной картиной гидролиза не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии неспецифических эндонуклеаз в препарате фермента.

Полученный таким способом препарат R Sau 6782 полностью свободен от неспецифических примесей и пригоден для любых видов структурных исследований. Выход фермента 1500 ЕД на 1 г биомассы, Удель- ная активность 70 тыс. ед/мг белка. Активность 3 тыс. ЕД/мл. Препарат хранится при -20°С в течение 3 лет без потери активности.

Сравнение показателей ферментного препарата R Sau 6782, полученных по пред-

латаемому способу и прототипу, представлено в таблице. Как видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет увеличить выход и активность R Sau 6782 в 1,5 раза, а также повысить его стабильность при хранении. Кроме того, предлагаемый способ более простой и технологичный и требует меньше времени для реализации.

Формул а изобретени я Способ получения рестриктирующей эндонуклеазы Sau 6782, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма Staphyfococcus aureus 6782, обработку бактериальной массы лизоста- фином. ультразвуковую дезинтеграцию, удаление нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония, катионообменную хрома- тографию на фосфоцеллюлозе Р II, о т л и- ча ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, сокращения продолжительности процесса и повышения выхода целевого продукта, катионообменную хррматографию на фосфоцеллюлозе Р II осуществляют непосредственно после высаливания белкое с использованием двойного комбинированного градиента повышающейся концентрации хлористого натрия от 0,0 до 1,0 М и снижающихся значений рН от 9,0 до 6.0.

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: клетки Staphylococcus aureus 6782 культивируют в ферментере на среде, приготовленной на основе триптического гидролизата казеина и дрожжевой воды, и осаждают центрифугированием. Бактериальную массу суспенди- руют в рабочем буфере рН 7,4, содержащем 10 мМ К-фосфат, 7 мМ ft -меркаптоэтанол и 1 мМ ЭДТА, добавляют лизостафин и инкубируют 20 мин при 20°С. Затем клеточную суспензию подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 105 тыс.д в течение 1 ч. Нэдбсадочная жидкость представляет собой грубый экстракт. Освобождают от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина. Высаливание белков проводят сульфатом аммония (СА) 80% насыщения. Осадок растворяют в рабочем буфере рН 9, диализуют от СА и наносят на колонку с ФЦ-Р11, уравновешенную тем же буфером со скоростью 10 мл/ч. Колонку промывают тремя объемами буфера и фермент элюируют двойным комбинированным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0,0 до 1,0 М и снижающихся значений рН от 9 до 6. При этих условиях R sau 6782 элюируется узким пиком в области 0,4- 0,45 М NaCI, а неспецифические нуклеазы элюируются близкими концентрациями NaC 0,45-0,55 М. Полученный препарат R sau 6782 содержит незначительное количество неспецифических примесей. Выход фермента составляет 1300ед. из 1 г. биомассы. Активность - 2500 ед./мл. Удельная активность - 60000 ед./мг. 2 ил. ел С 4 Ю О о 4 О

Характеристика препарата R Sau 6782

Тестирование примесей нсспецифйческих нуклеаэ в препарате RЈvo782.. :-аУлкгирс-8ание фрагментов рестрикции /электрофорез в агарозе/

-I фага /контроль/ ,

2 трек- фрагментыДЬК фга после гидролиза R 5782.

3 трек- лигироБ н-ле фрагмс-нтс13 рсстр икции ДИК-лйгазой фага Тг

б/ Тест/ с тЬ ческкм меченые слйгонуклеотидом.

I -Wffl±S S«. . « 32Р ИНД /король/

2 трек- СЬД после инкубации с R Ј /о762 в течение 18 часов.