Способ получения рестриктазы Т @ 201 @ Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/01 

например способ получения рестриктазы Mfe I из Microbacterium flovum, включающий наработку биомассы, получение грубого экстракта, фракционирование сульфатом аммония и хроматографическую очистку фермента на трех сорбентах с выходом 300 ед./г биомассы 3.

Недостатком данного способа является длительность процесса очистки фермента. Кроме того, рестриктаза Mfe I не гидролизует ДНК, содержащую 6-метиладенин в последовательности GATC, т.е. является чувствительной к метилированию dam-метилазой, что требует дополнительных затрат по получению неметилированной ДНК.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения рестриктазы Xho II из Xanthomonas holcicola 4, Данный способ включает наработку биомассы, получение грубого экстракта с по- следующей хроматографической очисткой на фосфоцеллюлозе (хроматография и ре- хроматография) и аминогексилсефарозе.

Однако используемый в известном способе штамм - продуцент содержит еще одну рестриктазу Xho Г, что усложняет процесс очистки фермента, требует рехроматогра- фии на фосфоцеллюлозе. К недостаткам данного способа также относится крайне низкий выход целевого продукта - около 100 ед./r биомассы (4000 ед. из 30 г).

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта.

Способ заключается в том, что исполь- зуют штамм термофильной бактерии Thermus ruber BKM B-1723D (ВС-201), продуцирующий единственную рестриктазу Тги 201 Г с повышенным ее содержанием. Штамм культивируют на питательной среде, клетки разрушают ультразвуком и проводят очистку фермента путем хроматографий на фосфоцеллюлозе и гепарин-сефарозе.

Пример. Культивирование штамма и получение биомассы.

Клетки Thermus ruber ВС-201 высевают из ампулы на твердую среду, содержащую 20% картофельного отвара, 0,5% пептона и 0,02% дрожжевого экстракта, инкубируют в течение 1 сут при 60°С, затем вносят петлей в 100 мл жидкой среды того же состава и выращивают в течение 24 ч при 60°С. Полученный инокулят вносят в 2 л жидкой среды того же состава и выращивают при 60°С в течение 14 ч на качалке при 60 об/мин. По- еле охлаждения клетки собирают центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Выход сырой биомассы 1 г с 1 л среды.

Получение и очистка рестриктазы Тги 201 I.

2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трис-HCI, рН 7.5, содержащего 10 М /3-меркаптоэтанола и 0,1% тритона Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость наносят на 20 л фосфоцеллюлозы Р-Н (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М К-фосфа т, рН 7,5, 0,001 М/ -мерка- птоэтанол,5-10 4ЭДТА), затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют 240 мл градиента 0-1,0 NaCI в буфере А. Обьем каждой фракции 8 мл. Аликвоту из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при 60°С с 1 мкг ДНК фага А и анализируют в геле агярозы. Фракции, расщепляющие ДНК фага А (21-23), объединяют, диализуют 4 ч против 2 л буфера А и наносят на колонку объемом 5 мл с гепарин-сефарозой (Pharmacia). Элю- цию проводят линейным градиентом NaCI 0-1.0 М в буфере А объемом 60 мл. Обьем фракций мл. Фракции(16,17), содержащие Тги 201 I, объединяют и диализуют против буфера Ас 50% глицерина. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность 2000ед./мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 65°С.

Ферментный препарат хранится при - 20°С. Из 1 г биомассы получают 1000 ед. рестриктазы Тги 201 Г.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тги 201 I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тги 201 Г, проводят гидролиз ДНК фага Т7 ре- стриктазами Тги 201 1 и Xho II по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Тги 201 1 и Xho II порознь и совместно, указывает на то. что рестриктаза Тги 201 I является изо- шизомером Xho II, узнает и расщепляет последовательность PuGATCPy.

Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: упрощает процесс получения целевого фермента (сокращается число стадий), обеспечивает выход целевого фермента в 8 раз выше.

Поскольку рестриктаза Тги 201 1 имеет сайт узнаваний, идентичный сайту Xho II.

f i

она может заменить эту рестриктазу во всех генно-имженерных работах.

Формула изобретения Способ получения рестриктазы Tru 201 Г. включающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, отделение клеток и разрушение их ультразвуком с последующей постадийной

хроматографической очисткой на сорбентах - фосфоцеллюлозе и производном сефарозы. отличающийся тем, что. с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют LUT;IMM Thermus ruber BKM B-1723D. а при хроматографической очистке в качестве производного сефарозы берут гепарин-сефарозу.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов PuGATCPy. С целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Thermus ruber BKM B-1723 D, а хроматографическую очистку ведут последовательно на фосфо целлюлозе и гепарин-сефарозе. Выход рестриктазы Fru 201 . составляет 100 ед./г биомассы. Идентична рестриктазе Xho II и во всех генно-инженерных работах может заменить ее. со XI О СО о 00 XI ком. хроматографическую очистку фермента 1. а также аналогичный способ получения рестриктазы Tth HB 8 из Thermus thermophilus HB 8 2. Однако использование этих способов не позволяет получить рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов PuGATCpy. Известны также способы получения ре-- стриктаз. узнающих и расщепляющих последовательность нуклеотидов PuGATCPy.