СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ Советский патент 1994 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/19 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии, а именно к системам одновременного получения ферментов рестрикции и модификации ДНК: рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) Есо R II и метилазы Есо R II.

Цель изобретения - более полное использование сырья за счет одновременного выделения метилазы Есо R II и рестриктазы Есо R II и сокращение времени процесса.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выращивают биомассу штамма Escherichia coli B 834 (r_B^-, m_B^- (/p SK 323, полученные клетки ресуспендируют в буфере (10 мМ фосфат калия, 1 мМ этилендиаминтетраацетат, 7 мМ 2 -меркаптоэтанол), содержащем тритон Х-100 (0,05-0,5% ) и лизоцим (50 мкг/мл). Затем клетки разрушают ультразвуком и центрифугируют 15000-100000 g, 1 ч, 4^оС. К супернатанту добавляют при перемешивании полиэтиленимин до концентрации 0,3-0,5% , осадок собирают центрифугированием и ресуспендируют в буфере, содержащем 0,3-0,4 М КСl или NaCl. Ферменты осаждают сульфатом аммония и затем сульфатаммонийную фракцию после диализа наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой. После промывания через колонку пропускают буфер с возрастающей концентрацией КСl от 0 до 0,3 М в объеме, равном 20-30 свободным объемам колонки, разделяя фракции, содержащие метилазу, элюируемые при концентрации буфера 0,08-0,12 М, и фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые в градиенте концентрации буфера 0,15-0,22 М. Дальнейшую хроматографию на фосфоцеллюлозе осуществляют раздельно для фракций метилазы и рестриктазы, элюируя раствором с градиентом концентрации KCl или NaCl (для метилазы 0,2-0,8 М, для рестриктазы - 0,1-0,6 М). Полученные фракции ферментов диализуют и концентрируют.

П р и м е р 1. Биомассу штамма Escherichia coli B 834/p SK 323 (100 г) ресуспендируют в холодном ФЕМ-буфере (10 мМ КРО₄, рН 7,0 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол), содержащем 0,1% тритона Х-100 и лизоцима 50 мкг/мл. На 100 г биомассы берут 300 мл буфера. Полученную густую суспензию инкубируют 30 мин, при 4^оС, а затем клетки разрушают ультразвуком.

Разрушение клетки центрифугируют (20000 g, 1 ч, 4^оС). Осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют при перемешивании полиэтиленимин из расчета на каждые 10 мл супернатанта 0,4 мл 10% -го раствора полиэтиленимина в воде при концентрации белка в супернатанте около 10 мг/мл. Выход рестриктазы на этой стадии составляет 96% по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта, удельная активность 7,2 ˙10³ ед/мг белка, а выход метилазы Есо, R II-96% , удельная активность 7,26 ˙10³ ед/мг белка.

Осадок выбирают центрифугированием и ресуспендируют в 300 мл ФЕМ-буфера, содержащего 0,4 М КСl. Затем осадок удаляют центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют при перемешивании насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄ до конечной концентрации 60% (обычно на 100 мл раствора берут 150 мл (NH₄)₂SO₄. Осадок собирают центрифугированием и ресуспендируют в 300 мл ФЕМ-буфера. Сульфат-аммонийную фракцию после диализа против ФЕМ-буфера наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешенной ФЭМ-буфером. После нанесения колонку промывают ФЕМ-буфером до тех пор, пока оптическая плотность не станет равной оптической плотности ФЕМ-буфера. Далее через колонку пропускают ФЕМ-буфер с возрастающей концентрацией КСl от 0 до 0,3 М (25 свободных объемов колонки). Метилаза Есо R II элюируется при концентрации от 0,08 до 0,12 М КСl, а рестриктаза Есо R II от 0,15 до 0,22 М KCl.

Фракции, содержащие активность метилазы Есо R II, объединяют и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой. Колонку промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,2 М KCl, затем через колонку пропускают ФЕМ-буфер с возрастающей концентрацией КСl от 0,2 до 0,8 М. Метилаза Есо R II элюируется при концентрации от 0,3 до 0,6 М КСl. Выход метилазы Есо R II составляет 12˙ 10⁶ ед. , 30% по отношению к стадии фракционирования сульфатом аммония. Фракции, содержащие активность рестриктазы Есо R II, объединяют, разводят в два раза ФЕМ-буфером и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой. Колонку промывают ФЕМ-буфером, содержащим 0,1 М КСl, затем ФЕМ-буфером с возрастающей концентрацией КСl от 0,1 до 0,6 М. Рестриктаза Есо R II элюируется от 0,2-0,5 М. Выход рестриктазы Есо R II составляет 20% по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта. Активные фракции метилазы Есо R II и рестриктазы Есо R II диализуют в течение 16 ч против 50 объемов ФЕМ-буфера, содержащего 0,2 М КСl и 50% (объем/объем) глицерина.

Выход рестриктазы Есо R II составляет 20% , удельная активность 6,5 ˙10⁵ ед/мг белка. Выход метилазы Есо R II составляет 20% , удельная активность 4,5 ˙10⁵ ед/мг белка.

П р и м е р 2. Способ выделения ферментов Есо R II проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что для осаждения используют полиэтиленимин, добавляя его к бесклеточному экстракту до конечной концентрации 0,3% . Выход рестриктазы на этой стадии Есо R II составляет 85% с удельной активностью 7,6 ˙10³ ед/мг белка, а выход метилазы Есо R II - 75% , с удельной активностью 5,9˙ 10³ ед/мг белка по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта. Элюзию ферментов осуществляют, используя ФЕМ-буфер с возрастающей концентрацией КСl от 0 до 0,3 М (20 свободных объемов колонки). Выход рестриктазы Есо R II составляет 18% по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта. Выход метилазы Есо R II составляет 28% по отношению к стадии фракционирования сульфатом аммония или 15% по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта. Активность рестриктазы 5,6˙ 10⁵ ед/мг белка, метилазы 4˙ 10 ⁵ ед/мг белка.

П р и м е р 3. Способ выделения ферментов Есо R II проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что в состав дезинтегрирующей смеси вносят тритон Х-100 в концентрации 0,5% , для осаждения используют полиэтиленимин, добавляя его к бесклеточному экстракту до конечной концентрации 0,5% . Выход рестриктазы Есо R II составляет 98% с удельной активностью 5,63˙ 10³ ед/мг, а метилазы Есо R II - 98% с удельной активностью 5,67 ˙10³ ед/мг белка по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта.

Элюцию ферментов осуществляют, используя ФЕМ-буфер с возрастающей концентрацией КСl от 0 до 0,3 М (30 свободных объемов колонки). Выход рестриктазы Есо R II 17% , удельная активность 4,5˙ 10⁵ ед/мг белка, выход метилазы Есо R II 17% по отношению к стадии получения бесклеточного экстракта, удельная активность 4 ˙10⁵ ед/мг белка. (56) Rouland-Dissjoix Detal, 1975. Microbiology, 1974. (D. Schlessinger, Ed), р. 187-206.

Косых В. Г. Выделение, очистка и характеристика рестрикционной эндонуклеазы Есо R II. Биохимия, т. 47, вып. 4, 1982, с. 619-625.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИEco R 11 из бесклеточного экстракта штамма Escherichiacoli B 834 ( r_в^- , m_в^- ) /pSK 323, включающий получение биомассы, обработку клеток дезинтегрирующей смесью, содержащей фосфат калия, этилендиаминтетрауксусную кислоту, меркаптоэтанол и лизоцим, отделение экстракта, осаждение фермента полиэтиленимином, экстракцию фермента раствором хлористого калия или хлористого натрия, осаждение из экстракта сульфатом аммония, диализ, хроматографию диализата на диэтиламиноэтилцеллюлозе, ипользуя для элюции раствор с градиентом концентрацией хлористого калия или хлористого натрия, последующую хроматографию на фосфоцеллюлозе в градиенте концентрации того же буферного раствора и концентрирование диализом против глицерина, отличающийся тем, что, с целью полного использования сырья за счет одновременного выделения метилазы Eco R 11 и рестриктазы Eco R 11 и сокращения продолжительности процесса, в дезинтегрирующую смесь дополнительно вносят тритон Х-100 в концентрации 0,05 - 0,5% , раствор полиэтиленимина добавляют к бесклеточному экстракту до концентрации 0,3 - 0,5% , элюцию ферментов с диэтиламиноэтилцеллюлозы осуществляют, используя буферный раствор хлористой соли калия или натрия в объеме, равном 20 - 30 свободным объемам колонки, с концентрацией, возрастающей до 0,3 М, разделяя фракции, содержащие метилазу, элюируемые при концентрации буфера 0,08 - 0,12 М, и фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые в градиенте в концентрации буфера 0,15 - 0,22 М, а дальнейшую хроматографию на фосфоцеллюлозе осуществляют раздельно для фракции метилазы и рестриктазы.