Способ количественного определения каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 C12N9/54 

Изобретение относится к аналитической химии ферментов, а именно к способам количественного определения каталитически активных молекул ферментов в биологических и биотехноло- гичаских препаратах.

Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа.

Способ осуществляют следующим образом..

Пример 1. В лунки стандарт- ньк полистиролрвых микропланшетов для иммуноферментного анализа вносят

по 100 мкл 0,1 И калий-фосфатного буфера, рН 6,3, содержащего овомукоид из белка яиц утки в концентрации 0,1 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 2 ч, затем удаляют из лунок раствор отсасыванием и вносят 100 мкл 1%г-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере. После 30 мин инкубации при 37 С лунки 4-кратно промывают 0,05 К калий-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,1 У Nad и 0,05% твина-20 (буфер X), и вносят анализируемую пробу, содержащую сериновую протеинаS5

о а ;о

4

зу бацилл, разбавленную буфером X не енее, чем в 2 раза. Планшет инкубиуют 20 мин при 37°С, 4-кратно проывают буфером X и вносят по 100 мкл раствора конъюгата-поликлональньк кроличьих антител против сериновой протеиназы с пероксидазой в концентрации 1,2 мкг/мл по пероксидазе (Конъ- югат синтезирован из IgG, вьщеленных из сывороток с титром в ИФА 1:100000, и пероксидазы хрена с RZ- 3,0 перио- антным методом). Длительность инку- бации - 60 мин. Далее после четырех отмывок буфером X и одной - дистиллиованной водой в лунки вносят раствор 5-амин о салициловой кислоты (5,0 мМ) + НгОг (1,8 мМ), рН 6,0, и после 10 мин инкубации при комнатной ратуре определяют оптическую плотность при 490 нм.

На фиг. 1 изображен типичный кали- бровочный график анализа. Чувствительность анализа - до 10 иг/мл. Средняя ошибка в серии измерений - 4,6%.

П. р и м е р 2. Анализ проводят в соответствии с примером 1, но ад -- сорбцию ингибитора проводят при +4 в течение 16 ч. При этом чувствительность и точность определения не отичаются от примера 1.

Пример 3. В лунки полистироловых микропланшетов вносят по 100 мкл 0,1 К калий-фосфатного бз/ фе- ра, рИ 7,0, содержащего ингибитор се- риновых протеиназ из семян кукурузы, в концентрации 0,8 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 16 ч. затем удаляют из лунок раствор отсасыванием и вносят 100 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере. После 30 мин инкубации при лунки 4-кратно промывают буфером X (как в примере 1) и вносят анализируемую пробу, содержащую сериновую протеиназу бацилл, раз- равленную буфером X не менее чем в 2 раза. Кикропланшет инкубируют 10 мин при и проводят дальнейший анализ по методике, приведенной в примере 1, вплоть до отмывки от иш(унопе роксидазного конъюгата. После отмывки в лунки вносят по 100 мкл 3,7 мМ раствора орто-фенилендиамина в 30 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, с 1,8 мМ HjOj. Микропланшет вьщерживают 10 мин в темноте при комнатной температуре, а затем останавливают реак

5

0

5

0

5

0

5

0

5

цию, добавляют по 50 мкл 0,5 К HjSO. Оптическую плотность измеряют при 490 нм.

На фиг. 2 изображен калибровочньй график анализа. Чувствительность анализа - 1 нг/мл. Средняя ошибка определения - 3,4%.

Пример 4. В лунках микро- планшетов проводят иммобилизацию мукоида из белка яиц утки и обработку .бычьим сывороточным альбумином в соот- ветствии с примером 1. После отмывки от альбумина буфером X микропланшет промьшают дистиллированной водой, высушивают и хранят при до 3 мес.

Далее анализ проводят в соответствии с примером 1, но концентрация г конъюгата составляет 2,0 мкг/мл (по содержанию пероксидазы).

Чувствительность определения - 10 нг/мл, средняя ошибка - 8-10%, рабочий диапазон калибровочного графика достоверно не отличается от примера 1.

Предлагаемьй способ по сравнению с известным позволяет увеличить чувст-- вительность определения ферментов более чем в 100 ра, сократить время анализа более чем в 4 раза, а также существенно повысить специфичность анализа и упростить способ его проведения, для которого может использоваться стандартное оборудование для иммуноферментного анализа, имеющееся во многих исследовательских и клинических лабораториях.

Формул а- изобретения

Способ количественного определения каталитически активных молекул сери- новых протеиназ -бацилл, предусматривающий проведение реакции анализируемого фермента с иммобилизованным на твердой фазе реагентом, специфически связывающимся с активньпу центром фермента, и детекцию образовавшегося комплекса путем взаимодействия со специфическими антителами, меченными другим ферментом, с последующим определением активности связавшейся метки, отличающийся тем, что,.с целью Повьш1ения чувствительности и специфичности анализа, в качестве реагента, специфически связывающегося с активным центром фермента, исполь« - зуют овомукоид из белка утиных яиц или белковый ингибитор сериновых про- . теиназ из семян кукурузы.

ОЛ

0.5

01

W

г.

Ю С.пкг

Изобретение относится к аналитической химии ферментов и представляет собой способ количественного определения каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл. Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности анализа. Анализируемый фермент взаимодействует с иммобилизованным на твердой фазе овомукоидом из белка утиных яиц или белковым ингибитором сериновых протеиназ из семян кукурузы. Полученный комплекс обрабатывают антителами к этому ферменту,меченными другим ферментом с более высокой активностью. Детекцию осуществляют по активности связавшейся метки. 2 ил.

ОЛ

0

0.