Штамм бактерий кURтнIа ZopFII-продуцент рестрикционной эндонуклеазы кZо 91 Советский патент 1988 года по МПК C12N9/16 

4 4i

О СО

СО

Изобретение относится к микробиологии, в частности к получению штаммов - продуцентов рестриктаз.

Цель изобретения - выявление штам- Maj упрощение и удешевление процесса получения его рестриктазы, обладающей способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GATC,

Изобретение предусматривает испольН зование кепатогенного штамма Kurthia Zopfii 9 ВКЛМ В-3668 - продуцента рестриктазы, культивирование проводят в питательной среде LB при в условиях аэрации, клетки разрушают ультразвуком, затем проводят хроматогра- фическую очистку фермента.

Используемый штамм Kurthia zopfii 9 выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов обитающих в Аральском море, и хранится в ВКПМ ВНИИ генетики под регистрационным номером В-3668.

Штамм обладает следующими морфоло гическими, культуральными и физиологическими свойствами,

В молодых культурах (18-24 ч) - правильные неразветвленные палочки с закругленными концами, встречаются в цепочках, которые часто параллельны, диаметр палочек около 0,8 мкм, ртинa часто варьирует в зависимости от стадии роста, но обычно 2-8 мкм. Старые культуры (3-7 дней)состоят из кокковидных клеток, образованных при фрагментации палочек; палочки движут ся при помощи перитрихальных жгутиков. Эндоспор не образуют, Грамполо- жительные, некислотоустойчивые хемо- органотрофы.Метаболизм дыхательный, не бродильный. Каталазоположительные оксидазоотрицательные . Не восстанавливают нитраты. Не образуют кислоту из углеводов или многоатомньк спиртов, подщелачивают среду.- Строгие аэробы. Температурный оптимум 25- , пределы . Хороший рост в присутствии 4-6% NaCl. Полученная рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов GATC; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-9,0; оптимальная температура действия для активности рестриктазы требуются ионы Mg , оптимальная концентрация 5-15 мМ.

Пример. Получение рестриктазы Kzo 9 1 из Kurthia zopfii 9. Клетки .Kurthia zopfii 9, хранящиеся в 50%-ном глицерине в L-бульоне (ЬВ) состава, г: триптон 10, дрожжевой экстракт 3, NaCl 10, вода до 1 л при 20 С, высевают на чашку с L-агаром, После 2 сут инкубирования при 30°С клетки собирают петлей и вносят в 100 мл LB и выращивают до плотности 1,5 при .

Затем культуру вносят в 2 л LB и вьфашлвают до плотности 2,5 при После охлаждения клетки собирают центрифугированием. ВЬЕХОД биомассы 2 г сырого веса с i л среды.

0

5

30

35

40

45

50

55

4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера , рН 7,5, содержащего 10 MyS-меркаптоэтанол и 0,1%-ный тритон Х-100 и разрушают на ультразвуковом дизинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при ) и надосадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М К-фосфат, рН 7,5, 0,001 М -меркаптоэтанол, ЭДТА) 5 и затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-по- глощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюиру;от раствором 1 М NaCl -в буфере А. 60 мл полученного смыва белков с колонки ди- ализуют ночь против 2 л буфера А и затем наносят на 10 мл ДЕАЕ - целлюлозы (ДЕ-52, VJhatman, Англия), уравновешенной буфером А, и элюируют 100 мл градиент 0-1,0 М Nad в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликвоты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при с 1 мкл ДНК .фаза Л и анализируют в геле агарозы. .Фракции, расщепляющие ДНК фага (8- П), объединяют, диализуют 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4. мл фосфоцеллюлозы Р-1,1 (Whatman, Англия) и злюируют 40 мл градиент 0-1,0 в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие Kzo 9 1, определяют так же, как при хроматографии на даАЕ-целлкшозе. Фракции 12-13, со- держагдае Kzo9 1, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего :0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (I мл) имеет удельную активность 0000ед/мл..

3иД

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при .

Ферментный препарат хранят при . Из I г биомассы получают 2500 единиц рестриктазы Kzo 9 1.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Kzo 9 1.

Дпя определения последовательности нуклеотрщов, узнаваемой рестриктазой Kio 9 1, проводят гидролиз ДНК фага д рестритстазаки Kzo 9 I, Sau 3AI по отдельности, а также .совместный гидролиз этими рестриктазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Kzo 9 1 и Sau ЗА1 порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Kzo 9 1 является изошизомером рестриктазы Sau 3AI,узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GATC.

Рестр1Пчтаза из Kurthia- zopfii. 9 названа Kzo 9 согласно общепринятой номенклатуре.

Формула изобретения

Штамм бактерий Kurthia zopfii 9 BKTIM В-3668 - продуцент рестрикциок- ной эндонуклеазы Kzo 9 1 ,