Штамм бактерий АсINетовастеR саLсоасетIсUS продуцент рестриктазы Аса 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собойштамм,продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCANsTGG-3 .

Рестриктаза данной специфичности, может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов, а также является удобной моделью для изучения механизмов белокнуклеино- вых взаимодействий.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего одну сайт-специфическую рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CCANsTCC-З .

Новый штамм Aclnetobacter calcoacetlcus - продуцент рестриктазы Аса

I выделен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов рестриктаз в пресной воде методом скрининга и хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика, коллекционный номер ВКПМ В- 4721.

Штамм A.calcoaceticus ВКПМ В-4721 ха- ратеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки кокковидные. в основном расположены парами 0,5-0,8 мкм. грамотрица- тельные. На МПА образуют средние, блестящие, выпуклые колонии с ровными краями. На синтетической среде с ацетатом образуют мелкие беловатые колонии.

Физиологические признаки.

Хемо органотроф. Аэроб, каталазополо- жительный. оксидазоотрицательный. НедаО О

N Ю

ет роста при замене ацетата глюкозой и/или маннитом. Нет роста на безазотистой среде Эшби с глюкозой, маннитом и ацетатом. Глюкозу не окисляет и не сбраживает. Сероводород не образует. Индолотрицатель- ный. Устойчив к ампициллину, хлорамфени- колу, чувствителен к тетрациклину, канамицину, стрептомицину. Доля GC в ДНК-42% (по плавучей плотности). Культуральные признаки. Дает рост на МПА, при температурном диапазоне от 5 до 30° С. Оптимальная температура 25° С. Оптимальный рН 7. Растет при 0,5-3% NaCI. Оптимальная для роста 0,6% NaCI. Требователен к аэрации. Хранение осуществляют под вазелиновым маслом в 30%-ном глицерине при 70° С.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выдепение ресгриктазы.

Ночнуюкультуруштамма

A.calcoaceticus засевают в свежую питательную среду, состоящую из 10 г/л трипто- на (Difco); 5 г/л дрожжевого экстракта (Sen/a }; 6 г/л Nad; остальное вода. Культивируют при 25° С в термостатированной качалке в двухлитровых колбах с 200 мл тпзтельной среды при 200 об/мин до достижения логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4° С. 10 г клеток суспендируют в 30 мл 0,02 М трис-HCI буфере, рН 7,5, содержащем /9-меркаптоэтанол и О, %трион Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (1200хд, 30 мин), надосадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5 m (Bio-Rad), объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М калийфосфат- ным буфером, рН 7,5, содержащим М / -меркаптоэтанол; ЭДТА; 0,8 М Nad; 0,1% тритон Х-1,00, (буфер А). Фермент элю- ируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие рестриктаз- ную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 1хЮ 3М/ -меркаптоэ- танол и М ЭДТА (буфер В), меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАЕ-целлюлозой (DE- 52, Whatman), урановешенную буфером В.

Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента NaCI (0-1 М) в буфере В. Фракции, элюируемые при ,3 М NaCI, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют против 2 л буфера В. Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (P-ll, Whatman) объемом 10 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку

тем же буфером. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента NaCI 0,0-1 М в буфере В. Фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые при 0,53-0,6 М NaCI, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего

0,1 М NaCI и 50%-ный глицерин.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного

гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза указывает, что эти ферменты узнают ь расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5 -CCAN5TGG-3 .

Выход фермента Аса I определяют по

электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага в течение 1 ч при 37° С. Выход фермента составляет 1000 ед./г, активность 5000 ед./мл.

Предложенный штамм-продуцент является уникальным. Впервые в роде

Acinetobacter найден продуцент рестрикта- зы, способной узнавать и расщеплять по- следовате льность нуклеотидов 5 -CCФN5TGG-3 .

Культивирование предлагаемого штам0 ма является простой и воспроизводимой процедурой, не требующей дорогостоящего оборудования. Полученный штамм позволяет получать рестриктазу с выходом не менее 1000 ед./r сырой биомассы, пополнив ас5 сортимент рестриктаз, выпускаемых отечественной промышленностью.

Формула изобретения

0 Штамм бактерий Acinetobacter calcoacetlcus ВКПМ В-4721 - продуцент ре- стриктазы Аса I.

Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под коллекционным номером ВКПМ В-4721, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма на питательной среде при 25°С в термостатированных качалках до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток, из которых после дезинтеграции ультразвуком и хроматографических очисток получают фермент Аса 1, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5^Ъ - CCAN₅TGG -3^Ъ. ВЫХОД ФЕРМЕНТА 1060 ЕД/Г, АКТИВНОСТЬ 5000 ЕД/МЛ. ШТАММ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, КОТОРУЮ ПРИМЕНЯЮТ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ И ДЛЯ ФИЗИЧЕСКОГО КАРТИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК.