Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению эндо- нуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC.
Целью изобретения является выявление нового штамма - продуцента.
обеспечивающего более высокий выход целевого продукта, непатогенного для человека и нетребовательного к питательным средам.
Штамм бактерий Paracoccus denitrif leans ВКПМ В-415 2 выделен вреэуль-- тате поиска штаммов-продуцентов
ростриктаз среди микроорганизмов, о(5итающих в озере Балхаш, .-,
Штамм Paracoccus denitrifleans В--4152 характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: клетки с(Ьерические 1-1,1 мкм в диаметре, встречаются поодиночке, в парах или а:-регатах„ В молодых культурах могут встречаться короткие палочковидные клетки. Неподвижные. Накапливают поли В-оксибутираТо ГрамотрицаТельные. Метаболизм дыхательный. Реакции на ок- С1дазу и каталазу положительные. Не Г1ЛОФИЛЫ, нет потребностей в росто- в )Гх факторах, желатину не разжижают Шгамм хранится в 50%-ном глицерине в, L-бульоне при t -20°С.
На рыбопептонном агаре образует колонии серовато-белые, блестящие 8-9 мм в диаметре с неровными краями, плоские, не врастают в агар. Рост обильньш. В РПБ образует равномерную муть, осадок. Хороший рост на синте- тртеской среде с минеральным азотом.
Продуцируемая предпагаемым штаммом ;стриктаза характеризуется следую- ми свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нукл отидов GGNCC; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-9,0; оптимальная температура действия для активности рестриктазы требуются ионы Мо , оптимапьная концентрация 5-15 мМ.
Для культивирования Par.den В-4152 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной во
ры; триптон 10, дрожжевой экстракт
Культивирование проводят при 4 хорошей аэрацией в течение 2 сут. ыход биомассы 2-3 г/л культуральной } сидкости. Выход рестриктазы Pde 12 1: 45 ед/г биомассы.
Пример. Клетки Par. den., :(сранящиеся в 50%-ном глицерине в L- Ьульоне при t -20 С высевают на чаш- ijcy с L А. После 2 сут инкубирования |1ри клетки собирают петлей и вносят в 100 мл В и выращивают до Плотности 1,5 при . Затем куль- Ьуру вносят в 2 л В выращивают до Ьлотности 2,5 при . После охлаж- Йения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 2,3 г сырого вес b 1 л средьк.
5.
0
S
5
п
0
5
0
5
0
5
4 г клеток суспендируют в 20 мл 0.02 М буффера трис-НС1 рН 7,5, содержащего 0,001 м /2|-меркаптоэтанол и 0,1% тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. .Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при ) и на- досадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М калийфос- фатный буфер, рН 7.5; 0,001 М,6-мер- каптоэтанол, 5 ЭДТА), затем колонку промьшают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате.
Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М NaCl в буфере А. Затем 60 мл полученного смыва белков с колонией диализуют в течение ночи против 2 л буфера Л и наносят на 10 мл ДЕАЕ- целлюлозы (,ЦЕ-52, Whatman, Англия), уравновешенной буфером А и элюируют 100 мл градиентом 0-1,0 М NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Али- кваты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при с 1 мкл ДНК фага С1857 и анализируют в геле агарозы. Фракции, расщепляющие ДНК фага / (7-9), объединяют, диализугот 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman, Англия) и элюируют 40 мл градиентом 0-0,1 М NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие Pde 12 I, определяют также, как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции 14, 15, содержащие Pde 12 I, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет удельную активность 12000 ед/мл. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, нег.-б- ходимое для полного расщепления 1 йкл ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С. Ферментный препарат хранят . при . Из 1 г биомассы получают 3000 ед. рестриктазы Pde 12 I.
Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рест- риктазой Pde 12 I, проводят гидролиз дак фаза и pBR 322 рестрикта- зами Pde 12 I и Sau 96 1 по отдельности, а также совместный гидролиз iэтими рестриктазами. Наблюдается .картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Pde 12 I и Sau 96 I
/
515325836
порознь и совместно, указывает наный выход целевого фермента, состав- то, что рестриктаза Pde 12 I явля-ляющий 3000 ед/г биомассы (в 12 раз ется изомером рестриктазы Sau 96 I,больше, чем в прототипе), узнает и расщепляет последователь- Формула изобретения ность нуклеотидов GGNCC.
Полученный штамм непатогенен дляШтамм бактерий Paracoccus denitriчеловека; легко разрушается ультра-ficans ВКПМ В-4152 - продуцент эндозвуком, а также обеспечивает повьшен-нуклеазы рестрикции Pde 12 I.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Штамм бактерий ВRеVIвастеRIUм IммотUм - продуцент эндонуклеазы рестрикции В @ 1 | 1988 |
|
SU1532584A1 |
Штамм бактерий кURтнIа ZopFII-продуцент рестрикционной эндонуклеазы кZо 91 | 1987 |
|
SU1440919A1 |
Штамм бактерий BacILLUS SpecIeS 21-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы RSe21 1 | 1988 |
|
SU1518372A1 |
Штамм бактерий АсINетовастеR саLсоасетIсUS продуцент рестриктазы Аса 1 | 1989 |
|
SU1661212A1 |
Штамм SтRертомYсеS FRaDIae - продуцент рестриктазы SFR I | 1988 |
|
SU1645300A1 |
Способ получения рестриктазы Т @ 201 @ | 1989 |
|
SU1703687A1 |
Штамм бактерий FLаVовастеRIUм аQUатILе - продуцент рестриктазы FaU I | 1989 |
|
SU1661213A1 |
ШТАММ БАКТЕРИИ Arthrobacter species Mn372-ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Asi372I, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5`-ATGCAT-3` | 2005 |
|
RU2302459C2 |
ШТАММ БАКТЕРИИ Paenibacillus sp., ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ Psp1009I | 2007 |
|
RU2340663C1 |
Штамм бактерий BacILLUS SтеаRотнеRморнILUS - продуцент рестриктазы BSS TI | 1989 |
|
SU1686000A1 |
Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцента PARACOCCUS DENITRIFICANS ВКПМ В - 4152, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции PDE 12 1, являющейся изошизомером рестриктазы SAU 96 1 и способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, непатогенен для человека, нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 3000 ед/г биомассы. Штамм PARACOCCUS DENITRIFICANS В - 4152 продуцирует эндонуклеазу рестрикции PDE 12 1, имеет сайт узнавания GGNCC, идентичный сайту узнавания SAU 96 1.
Roberts R.I | |||
Restriction and | |||
modification enzymes and their rocognition seguences | |||
- Nucl | |||
Acids | |||
Res, 1985, 13 | |||
Suppl | |||
Устройство для отыскания металлических предметов | 1920 |
|
SU165A1 |
Jentsch S., GunthertU., Trau- ther T.A | |||
Nucl | |||
Acids Res | |||
Приспособление для изготовления в грунте бетонных свай с употреблением обсадных труб | 1915 |
|
SU1981A1 |
Hyghes S.G., Bruce T | |||
and Murray K | |||
Способ получения фтористых солей | 1914 |
|
SU1980A1 |
Sussenbach I.S., Steenbergh P.M., Rost I.A., Van De emven W.I., Van Enbden I.D.A | |||
,A second site - specific reistriction endonuclease from sta- phylococcus aureus | |||
- Nucl | |||
Acids | |||
Res | |||
Чугунный экономайзер с вертикально-расположенными трубами с поперечными ребрами | 1911 |
|
SU1978A1 |
Авторы
Даты
1989-12-30—Публикация
1988-03-15—Подача