Штамм бактерий PaRacoccUS DеNIтRIFIсаNS-продуцент эндонуклеазы рестрикции Р @ 121 Советский патент 1989 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению эндо- нуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC.

Целью изобретения является выявление нового штамма - продуцента.

обеспечивающего более высокий выход целевого продукта, непатогенного для человека и нетребовательного к питательным средам.

Штамм бактерий Paracoccus denitrif leans ВКПМ В-415 2 выделен вреэуль-- тате поиска штаммов-продуцентов

ростриктаз среди микроорганизмов, о(5итающих в озере Балхаш, .-,

Штамм Paracoccus denitrifleans В--4152 характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: клетки с(Ьерические 1-1,1 мкм в диаметре, встречаются поодиночке, в парах или а:-регатах„ В молодых культурах могут встречаться короткие палочковидные клетки. Неподвижные. Накапливают поли В-оксибутираТо ГрамотрицаТельные. Метаболизм дыхательный. Реакции на ок- С1дазу и каталазу положительные. Не Г1ЛОФИЛЫ, нет потребностей в росто- в )Гх факторах, желатину не разжижают Шгамм хранится в 50%-ном глицерине в, L-бульоне при t -20°С.

На рыбопептонном агаре образует колонии серовато-белые, блестящие 8-9 мм в диаметре с неровными краями, плоские, не врастают в агар. Рост обильньш. В РПБ образует равномерную муть, осадок. Хороший рост на синте- тртеской среде с минеральным азотом.

Продуцируемая предпагаемым штаммом ;стриктаза характеризуется следую- ми свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нукл отидов GGNCC; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-9,0; оптимальная температура действия для активности рестриктазы требуются ионы Мо , оптимапьная концентрация 5-15 мМ.

Для культивирования Par.den В-4152 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной во

ры; триптон 10, дрожжевой экстракт

Культивирование проводят при 4 хорошей аэрацией в течение 2 сут. ыход биомассы 2-3 г/л культуральной } сидкости. Выход рестриктазы Pde 12 1: 45 ед/г биомассы.

Пример. Клетки Par. den., :(сранящиеся в 50%-ном глицерине в L- Ьульоне при t -20 С высевают на чаш- ijcy с L А. После 2 сут инкубирования |1ри клетки собирают петлей и вносят в 100 мл В и выращивают до Плотности 1,5 при . Затем куль- Ьуру вносят в 2 л В выращивают до Ьлотности 2,5 при . После охлаж- Йения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 2,3 г сырого вес b 1 л средьк.

5.

0

S

5

п

0

5

0

5

0

5

4 г клеток суспендируют в 20 мл 0.02 М буффера трис-НС1 рН 7,5, содержащего 0,001 м /2|-меркаптоэтанол и 0,1% тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. .Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при ) и на- досадочную жидкость наносят на 30 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М калийфос- фатный буфер, рН 7.5; 0,001 М,6-мер- каптоэтанол, 5 ЭДТА), затем колонку промьшают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате.

Адсорбированный материал элюируют раствором 1 М NaCl в буфере А. Затем 60 мл полученного смыва белков с колонией диализуют в течение ночи против 2 л буфера Л и наносят на 10 мл ДЕАЕ- целлюлозы (,ЦЕ-52, Whatman, Англия), уравновешенной буфером А и элюируют 100 мл градиентом 0-1,0 М NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Али- кваты из каждой фракции (1 мкл) инкубируют 1 ч при с 1 мкл ДНК фага С1857 и анализируют в геле агарозы. Фракции, расщепляющие ДНК фага / (7-9), объединяют, диализугот 3 ч против 2 л буфера А и наносят на 4 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman, Англия) и элюируют 40 мл градиентом 0-0,1 М NaCl в буфере А. Объем каждой фракции 2 мл. Фракции, содержащие Pde 12 I, определяют также, как при хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Фракции 14, 15, содержащие Pde 12 I, объединяют и диализуют против буфера А, содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет удельную активность 12000 ед/мл. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, нег.-б- ходимое для полного расщепления 1 йкл ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С. Ферментный препарат хранят . при . Из 1 г биомассы получают 3000 ед. рестриктазы Pde 12 I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рест- риктазой Pde 12 I, проводят гидролиз дак фаза и pBR 322 рестрикта- зами Pde 12 I и Sau 96 1 по отдельности, а также совместный гидролиз iэтими рестриктазами. Наблюдается .картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Pde 12 I и Sau 96 I

/

515325836

порознь и совместно, указывает наный выход целевого фермента, состав- то, что рестриктаза Pde 12 I явля-ляющий 3000 ед/г биомассы (в 12 раз ется изомером рестриктазы Sau 96 I,больше, чем в прототипе), узнает и расщепляет последователь- Формула изобретения ность нуклеотидов GGNCC.

Полученный штамм непатогенен дляШтамм бактерий Paracoccus denitriчеловека; легко разрушается ультра-ficans ВКПМ В-4152 - продуцент эндозвуком, а также обеспечивает повьшен-нуклеазы рестрикции Pde 12 I.

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является выявление штамма - продуцента PARACOCCUS DENITRIFICANS ВКПМ В - 4152, обеспечивающего получение эндонуклеазы рестрикции PDE 12 1, являющейся изошизомером рестриктазы SAU 96 1 и способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGNCC. Штамм выделен в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов, обитающих в озере Балхаш, непатогенен для человека, нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 3000 ед/г биомассы. Штамм PARACOCCUS DENITRIFICANS В - 4152 продуцирует эндонуклеазу рестрикции PDE 12 1, имеет сайт узнавания GGNCC, идентичный сайту узнавания SAU 96 1.