Способ получения ингибитора трипсина Советский патент 1988 года по МПК C12N11/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение, при выделении ингибитора трипсина с высокой степенью чистоты в биохимичес- кой промышленности.

Цель изобретения - повьпиение выхода и степени очистки ингибитора, а также ускорение процесса.

Способ заключается в том, что для получения ингибитора из субпродукта производства протеинового зеленого концентрата люцерны - кори шевого сока путем адсорбции на аффинном сорбенте, в качестве такого сор- бента используют поливиниловый спирт (ПВС) волокнистой структуры, а содержание трипсина устанавливают равным 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента, причем иммобилизацию трип сина прсв.одят с помощью ковалентного связывания с активированным п толуол сульфохлоридом поливиниловым спиртом При одинаковом содержании трипсина (60 мг/г сухого полимера) известный сорбент, полученный на основе полисахарида (сефарозы CL-6B) позволяет повысить чистоту ингибитора трипси™ на в 105 раз, в то время как ЦВС обеспечивает очистку его более чем в 150 раз. При этом выход ингибитора трипсина по активности составляет от 28 и до 31-38% соответственно. Волокнистая структура ПВС позволяет регулировать скорость прохождения препарата, содержащего ингибитор трипсина (коричневый сок, полученный из вегетативной массы тпоцерны), через слой сорбента, сократить длительность отмьшки его от неспецифи- чески сорбированных белков, а также значительно сократить время десорбци ингибитора трипсина с 240 мин при применении трипсинсодержащей сефарозы CL - 6В до 90 мин при использова- НИИ трипсинсодержащего ПВС в виде волокна.

Способ иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1, 1г свежесформованного ПВС волокна отмывают ацетоном от замасливателя и подвергают набуханию в пирцдине при 40 с в Te-чение 30 мин, после чего обрабатывают 10%-ным раствором п-толуолсуль- фохлорида в пиридине при 4 С в течение 20 мин. Пол енное ПВС волокно, содержащее 0,015 ммоль/групп толуол

0 5 0 5 0 c 0 5

п

5

сульфата, обрабатывают при рН 8,5 раствором трипсина с концентрацией 1 мг/мл при 40 С в течение 60 мин. Получают трипсинсодержащее ПВС волокно, в котором фермент в количестве 10 мг (0,4x10 ммоль) занимает место толуолсульфата. Количество прореагировавших гидроксипьных групп ПВС при степени полимеризации СП-1200 в среднем составляет п 21. Продукт промьтают дистиллированной водой и обрабатывают 100 мл коричневого сока люцерны, содержащего ингибитор трипсина, который с иммобилизованным трипсином об разует ког-тлекс. Разрушение этого комплекса (десорбцию) осуществляют 50 мл 0,1 НС1, активность ингибитора трипсина в растворе составляет 7,3% от исходной, а удельная активность повышается в 173 раза. Остальные пр1меры исполнены ана ло.гично.

Результата исследований сведены в таблицу.

Анализ данных таблицы показывает, что увеличение времени обработки от мытого от замасливателя и обезвоженного ацетоном ПВС-волокна после набухания в пиридине при 40 С, 10%-ньтм раствором п-толуолсульфохлорида в . пиррщине приводит к возрастанию содержания групп толуолсульфата от 0,015 ммоль/г до 0,07 ммоль/г. При взаимодействии.с трипсином происходит- замена активированных групп то- луолсульфата на белок, в связи с чем содержание трипсина в ПВС увели- чивается с 10 до 75 мг/г. Использование трипсинсодержащего волокна для вьщеления ингибитора трипсина из коричневого сока показывает, что увеличение содержания трипсина в ПВС

.влечет за собой згвеличение выхода ингибитора трипсина с 7,8 до 39% от начального содержания в коричневом соке. Степень очистки вьщеленного ингибитора трипсина уменьшается. УчИ тывая это, опт Ф1альное количество трипсина в ПВС составляет от 47 до 60 мг/г сухого сорбента.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет получать ингибитор торипсина из коричневого сока люцерны с большим выходом (31-38% вместо 28%) и с повьппей- ной степенью очистки (150-159 вместо 105), а также значительно ускорить процесс (на стадии десорбции с 240 мин до 90 мин).

.Одновременно волокнистая структура данного пол1 тмера обеспечивает осуществление технологического процесса выделения биологически активного препарата из многотоннажного растительного сырья по непрерывной

ра трипсина из субпродукта производства протеинового зеленого концентрата люцерны - коричневого сока на аффинном сорбенте, содержащем трипсин, ковалентно связанный с нерастворимым органическим носителем, активированным п-толуолсульфохлоридом, и десорбцию целевого продукта, о т

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при выделении ингибитора трипсина с высокой степенью чистоты в биохимической промышленности. Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки ингибитора трипсина, а также ускорение процесса. Способ заключается в адсорбции ингибитора трипсина из коричневого сока люцерны на аффинном сорбенте, представляющем собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный п-толуолсульфохлоридом, содержащий 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента-, и в последуюп;ей десорбции целевого продукта. Применение данного способа позволяет увеличить выход от 28 до 31-38% и степень очистки ингибитора от 105 до 150 - 159 раз, а также ускорить процесс. Способ быть использован для выделения ингибитор а из многотонажного сырья по зффективной технологической схеме благодаря деЩевизне и хороп1им фильтрующим характеристикам волокнистого поливинилового спирта. 1 табл. (Л 4. 4 О СО ю 4

схеме с использованием простых тех- юличающийся тем, что, с нических решений (фипьтры йз нетка-целью повышения выхода и степени

ного материала) с сокращением времени проведения процесса.

очистки ингибитора трипсина, а также ускорения процесса, в качестве аффинного сорбента используют полиФормула изобретения 15 виниловый спирт волокнистой структуры, & содержание трипсина устанавли- Способ получения ингибитора трип- вают равным 47-60 мг трипсина на 1 г

сина, вклйтчающий адсорбцию ингибито- сухого сорбента.

Характеристика процесса очистки ингибитора трипсина селективными сорбентами с paэлиqlfl m солержанием

t Коричневый I сок

Сефароза CL-6B

ПВС

11

rt

.

20

30

АО

60

90

120

180

60

0,015 .

0,027

0,041

0,054

0,063

0,080

0,070

1,15

10 0,4-10 27 1,03-10

47 1,88-10

J.

60 2,40-10

,-j

72 2,88-10

.-

75 3,10-10

-

75 3,10-10

-

21 50 00 120 142 166 166

60 15,0-10

-

100

7,3

23

31

л 38

39

39

39

28

100

0,04

0,13

0,14

0,15

0,17

0,17

0,17

0,16

1

173

167

159

150

139

139

139

105