Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Т Советский патент 1988 года по МПК C07K1/00 

N9

Изобретение относится к молекулярной биологии, точнее к белковой кристаллографии, и может быть использовано при исследовании пространст- венной структуры изучаемого белка методом рентгеностр.уктурного анализа.

На чертеже представлено устройство для осуществления способа.

Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Т с пространственной группой с параметрами ячейки ,4 Л ,9 А и углами а «(3 заключается в следующем. Капли раствора фермента в растворе, со- держащем осадитель - сульфат аммония, MES-буфер, 2-метил-пентандиол-2,4, наносят на поверхность силиконированно- го стекла, объем капель 10 - 30 мкл.

Q J5

25472

вести фермента) при концентрациях

фермента 0,5 - 2,0% с использованием в качестве осадителя полиэтиленглико- ля, сульфата аммония, 2-метилпентан- диола-2,4 (fflД), в отсутствии и в присутствии ионов цинка.

Условия роста следующие. Концентрация фермента в растворе 1,0 - 1,2%, рН раствора 5,9 - 6,2. Осадитель - сульфат аммония. Концентрация осадителя в ферментном растворе 10%, в насыщающем растворе 33 - .37%. Концентрация сульфата цинка в ферментном растворе. о

э -э

1x10 - 3x10 М, Температура 425 С. Время роста кристаллов - три- четыре недели.

В указанных условиях кристаллы вырастают достаточными по величине.

Изобретение относится к способу получения кристаллов карбоксипептида- зы Т, основанному на использовании . метода диффузии паров растворителя. К ферментному раствору в МЕ8-бу$ёре , добавляют сульфат аммония, 2-мётил- пентандиол-2,4 (МПД) и сернокислый цинк. В качестве насыщающего раствора применен раствор аналогичного состава с концентрацией сульфата аммония от 33 до 37%. Процесс кристаллизации ведут путем помещения капли ферментного .раствора, нанесенной на Iсиликонированное стекло, в герметич- i ную камеру с насыщающим раствором, содержащим сернокислый цинк, MES- буфер, МПД и сульфат аммония. 1 ил. (Л

Стекло помещают в чашку Петри с пред-20 однако значительная часть белка крис- лагаемым раствором, причем осадитель в более высокой концентрации - насыщающий растор. Края чашки Петри смазывают вакуумной смазкой и накрывают

таллизуется в виде игольчатых друз. Введение в ферментньш и насыщающий растворы ШЩ концентрации 3% подавляет рост друз, и фермент кристаллизуется в виде гексагональных бипирамид, . Увеличение концентрации сульфата аммония как в ферментном, так и в насыщающем растворах за указашгые пределы приводит к увеличению числа кристаллических зародышей и, тем самым, к уменьшению размеров выращенных кристаллов. При уменьшении концентрации сульфата- аммония нилсе указанного значения роста кристаллов не происходит,

|Стеклом, чтобы образовалась герметич ная камера (фиг.1). Для большей герметичности на поверхность стекла помещают груз, например, в виде стального диска. В такой камере первоначальный объем белковых капель уменьшается за счет перегонки паров растворителя из капли в насыщающий pacTiJOp. Эта перегонка продолжается до тех пор, пока не уравновесятся концентрации фермента и осадителя в капле и в насьпцающем растворе. Вызванное этим увеличение концентрации фермента приводит к выпадению его в виде аморфного или кристаллического осадка.

При указанных в предлагаемом способе условиях выращивают изометрич- ные, хорошо ограненные,./ кристаллы в форме гексагональных бипирамид, достигающие размеров 0,8x0,8x0,7 мм

По данным рентгенографического ис следования кристаллы карбоксипепти- дазы Т имеют параметры элементарной ячейки ,4 Л, ,9 А. Они принадлежат к пространственной группе Р65-22, Для полученных кристаллов собран набор интенсивностей дифракционных отражений с разрешением 3 А.

Условия кристаллизации карбокси- пептидазы Т разработаны на основе следующих экспериментальных данных, Опыты по выращиванию указанных кристаллов- проводят в MES-буфере в интервале рН 5,0-8,0 (интервал устойчи

0 однако значительная часть белка крис- 30

25

35

40

45

50

55

таллизуется в виде игольчатых друз. Введение в ферментньш и насыщающий растворы ШЩ концентрации 3% подавляет рост друз, и фермент кристаллизуется в виде гексагональных бипирамид, . Увеличение концентрации сульфата аммония как в ферментном, так и в насыщающем растворах за указашгые пределы приводит к увеличению числа кристаллических зародышей и, тем самым, к уменьшению размеров выращенных кристаллов. При уменьшении концентрации сульфата- аммония нилсе указанного значения роста кристаллов не происходит,

Пример 1 Препарат карбокси- пептидазы Т хранят в осажденном виде в 80%-ном сульфате аммония, 5 мл суспензии фермента в сульфате аммония центрифугируют при 12 тыс. об/мин, осадок растворяют в 300 мкл 0,05 М MES-буфера рН 6,0. В течение 24 ч отдиализовывают против 250 мл этого же буфера, центрифугируют раствор при 12 тыс. об/мин, сливают прозрач- ньш раствор. Объем раствора 400 мкл. Измеряют оптическую плотность раствора при 280 им на спектрофотометре, рассчитывают концентрацию белка, принимая оптическую плотность 0,1%-ного раствора за. единицу. Оптическая плотность , следовательно, концентрация белка 1,4%.

К 400 мкл полученного раствора карбоксипептидазы Т добавляют 15,6 мкл ШД, 53 мкл 4iM раствора сульфата аммония и 53 мкл раствора ZnSO с концентрацией 1х10 И, Суммарный объем раствора 521,6 мкл.

конечная концентрация фермента .10,8 мг/мл, т.е. 1,08%.

Полученный раствор каплями.по 20 мкл наносят на стекло, которое помещают в чашку Петри с 10 мл раствора, содержащего, мл: сульс|)ат аммония 3,5; ШД 0,3; 0,05 М ЖЗ-буфер (рН 6,0) 6,2.

Чашку герметизируют по описанному методу и оставляют при комнатной температуре. Через 3 недели в каждой капле образовываются кристаллы в виде ограненных гексагональных бипирамид

П р и М е р 4. Тот же ферментный раствор, что и в предыдущем опыте, наносят в виде капель на стекло, ко торое помещают в чашку Петри с насы щающим раствором (3,5 мл сульфата

размером до 0,8x0,8x0,7 мм. 15 аммония и 6,5 мл MES-буфера) , т.е.

П р и М е р 2. 4 мл суспензии фер- концентрацию сульфата аммония в на- мента в сульфате аммония отцентрифу- гируют, как в примере 1, растворяют в 200 мкл 0,05 М MES-буфера рН 6,2, отдиализовывают раствор против 200 мкл этого же .буфера, центрифугируют, сливают прозрачный раствор. Объем раствора 300 мкл. Измеряют кон20

сыщающем растворе снижают до 35%.

Через четыре недели в растворе образовываются кристаллы двух видов игольчатые друзы и мелкие ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, также не пригодные для исследований.

це 1трацию фермента, как описано выше;

, концентрация карбоксипептидазы 25 и 4) по кристаллизации карбоксипептиТ 1,5%.

К 300 мкл раствора добавляют 12 мкл МИД, 40 мкл 4М сульфата аммония и 40 мкл 2х10 М раствора ZnSO. Суммарньй объем 392 мкл. Конечная концентрация фермента 1,15%.- Полученный раствор каплями по 25 мкл наносят на стекло, как описано выше, которое помещают в чашку Петри. В чашке Петри

предварительно помещают 10 мл раство- вора 460 -мкл, конечная концентрация ра, содержащего, мл: 4М сульфат ам- белка 0,5% мония 3,3; fflД 0,3; 0,05 М MES-буфер

дазы Т проводят без. добавления ионов цинка и ШД.

Пример5. К 164 мкл ферментного раствора концентрацией 14 мг/мл, 30 полученного как и в предыдущих опытах, добавляют, мкл: ШД 14; 4 М сульфат аммония (15) 69; раствор 10 М ZnS04 46; 0,05 М MES-буфера (рН 6,0) 167. Конечный объем ферментного.раст(рН 6,2) 6,4, далее аналогично примеру 1. Через 4 недели получают кристаллы размером от 0,6x0,6x0,5 до

. 0,8x0,8x0,7 мм.

Далее приведены примеры, свидетельствующие о существенном влиянии на размер и форму кристаллов концентрации сульфата аммония в ферментном и насьпдающем растворах, а также о влиянии концентрации фермента и наличия ионов цинка и МПД.

При мерЗ. 7мл суспензии обрабатывают, как описано выше. Конечный объем ферментного раствора 650 мкл, концентрация белка 13 мг/мл.

.К 160 мкл полученного раствора добавляют 40 мкл 4 М раствора сульфата аммония. Конечный объем 200 мкл, конВ качестве насыщающего раствора используют 3,9 мл 4 М сульфата аммония и 6,1 мл 0,05 М MES-буфера рН 40 6,0. Через четыре недели в каплях вырастают ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, но размер их не превышает 0,3x0,3x0,2 мм.

45 Формула изобретения

Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Т характеризующихся пространственной группой Р с параметрами ячейки ,4 Л; с 106,9 А и углами of , заклю- чающшЧся в том, что из исходной суспензии фермента в сульфате аммония отделяют фермент центрифугированием, растворяют его в 0,05М lIES-бyфepe

50

- i..iJV, ,- iJ Ч..Л А X1-J i. Jl -

центрация сульфата аммония 20%, кон- рН 5,9...6,2, проводят диализ про- центрация белка 10,4 мг/мл. j этого же буфера и разбавляют

раствор до концентрации фермента 1,3...1,5%, к полученному раствору

Ферментный раствор в виде капель наносят на силиконированные стекла,

как в предыдущих опытах. В чашку Петри помещают 4 мл 4 М сульфата аммония и 6 мл 0,05М ЖЗ-буфера рН 6,0.

Через две недели в каплях образовываются длинные игольчатые кристаллы, собранные в друзы. Кристаллы мелкие, для дальнейших исследований не пригодны.

П р и М е р 4. Тот же ферментный раствор, что и в предыдущем опыте, наносят в виде капель на стекло, которое помещают в чашку Петри с насыщающим раствором (3,5 мл сульфата

аммония и 6,5 мл MES-буфера) , т.е.

концентрацию сульфата аммония в на-

сыщающем растворе снижают до 35%.

Через четыре недели в растворе образовываются кристаллы двух видов: игольчатые друзы и мелкие ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, также не пригодные для исследований.

Описанные эксперименты (примеры 3

и 4) по кристаллизации карбоксипептивора 460 -мкл, конечная концентрация белка 0,5%

дазы Т проводят без. добавления ионов цинка и ШД.

Пример5. К 164 мкл ферментного раствора концентрацией 14 мг/мл, 0 полученного как и в предыдущих опытах, добавляют, мкл: ШД 14; 4 М сульфат аммония (15) 69; раствор 10 М ZnS04 46; 0,05 М MES-буфера (рН 6,0) 167. Конечный объем ферментного.раст вора 460 -мкл, конечная концентрация белка 0,5%

В качестве насыщающего раствора используют 3,9 мл 4 М сульфата аммония и 6,1 мл 0,05 М MES-буфера рН 40 6,0. Через четыре недели в каплях вырастают ограненные кристаллы в виде гексагональных бипирамид, но размер их не превышает 0,3x0,3x0,2 мм.

45 Формула изобретения

Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Т характеризующихся пространственной группой Р с параметрами ячейки ,4 Л; с 106,9 А и углами of , заклю- чающшЧся в том, что из исходной суспензии фермента в сульфате аммония отделяют фермент центрифугированием, растворяют его в 0,05М lIES-бyфepe

i..iJV, ,- iJ Ч..Л А X1-J i. Jl -

рН 5,9...6,2, проводят диализ про- j этого же буфера и разбавляют

добавляют водный раствор сернокислог5

И

го цинка до концентрации 1.,.3-10 затем 4М водный раствор сульфата аммония до концентрации 10% и 2-ме- тил-пентандиол-2,4 (МПД) до концентрации 3% с достижением при этом конечной концентрации фермента 1... 1,2 мас.%, полученный раствор ферКап и , ;, / I

C{Mu/ o upoffaf / e Cfffef /io

Составитель И.Привалова Редактор Н.Гунько Техред М.Дидык Корректор С.Шекмар

Заказ 6355/23

Тираж 520

БНИИПИ Государственного комитета СССР

по делан изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

мента наносят на поверхность силико- нированного стекла в виде капель И помещают в герметичную камеру с,на- сьпцающим раствором, содержащим сернокислый цинк, MES-буфер, МПД в тех же концентрациях и сульфат аммония в концентрации 33 - 37%, процесс кристаллизации ведут при 5 - 25 С.

рас/г7дор

Подписное