Способ отбора мутантов SтRертомYсеS SрнеRоIDеS - продуцентов экзопротеазы с фибринолитической активностью Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 C12N9/50 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ, может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, а также в селекции и биохимии.

Цель изобретения - упрощение отбора и повышение выхода фермента.

Штамм Streptomyces spheroides R 35 культивируют после обработки ультрафиолетовыми лучами на средах с высокими концентрациями собственного протеолитического экзофермента, предварительно выделенного из куль- туральной жидкости продуцента.

Способ быстрого получения мутантов-сверхсинтетиков экзопротеаз основан на явлении подавления роста.спор исходного штамма собственным экзо- ферментом. Выделение мутантов, вырастающих.в условиях присутствия в среде высоких концентраций собственного фермента, добавленного в среду извне, т.е. в условиях полного подавления роста исходного штамма, позволяет из малого числа отобранных колоний получать продуценты с очень высокой протеолитической активностью фибринолитических протеаз.

Пример 1. Культуру штамма Str.spheroides № 35 выращивают в синтетических средах в аэробных условиях при 28°С на круговой качалке с 200- 220 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной йсидкости высаливанием сернокислым аммонием при 90% от полного насыщения после выдерживания в течение 24 ч при центрифугированием при 10 тыс. об/мин выделяют протеолити- ческий ферментный комплекс, который

гомогенизируют в минимальном объеме буфера трис-HCl, рН 7,5, и подвергаю диализу в течение 24 ч против этого же буфера. Полученный ферментный раствор (концентрации 10 мг/мл по белку), вносят в стерильные металлические из нержавеющей стали объемом 1 см3 цилиндры, стоящие на поверхности твердой среды для выращивания стрептомицетов, уже густо засеянные моноспоровой суспензией спор, содержащей 2.107-2.1 О8 спор стрептомицета в 1 мл фосфатного буфера 0,005 М, рН 7, подвергшейся предварительно облучению УФ-лучами в оптимальной для получения + вариантов дозе. Через 5 дней инкубации просматривают засеянные чашки Петри (среду в чашка Петри приготавливают с агаром в концентрации 1%, что обеспечивает лучшую диффузию фрагмента в агар, а посев густым газоном исключает стадию подбора концентраций высеваемых на чашки Петри суспензий, необходимую при рассеве на фибриновые среды, что значительно упрощает селекционную работу). Зона подавления роста стреп томицета при этом составляет 30-40 мм вокруг цилиндров с ферментом, и только единичные колонии все же вырастают в этом пространстве. Эти колонии ,отбирают и проверяют их способность к образованию экзопротеаз с фибрино- литическим действием. Мутанты выращивают на синтетических средах со стадией предварительного инокулиро- вания.

Пример 2. Культуру -штамма Str.spheroides № 35 выращивают на синтетических средах в аэробных условиях при 28°С на круговой качалке с 220-200 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл. Из культуральной жидкоста высаливанием сернокислым аммонием при 90% от полного насыщения, после выдерживания в течение 24 ч при +3°С центрифугированием при 10 тыс.об/мин, выделяют протеолитический ферментный комплекс, который гомогенизируют в минимальном объеме буфера трис-HCl, рН 7,5, и подвергают диализу в течение 24 ч, против этого же буфера. Полученный ферментный раствор в кон- центрации 15 мг/кг по белку вносят

0

Q 5

5

0

5

0

5

0

в стерильные цилиндры из нержавеющей стали, стоящие на поверхности твердой среды. Далее операции аналогичны примеру 1. Зона подавления роста : стрептомицета при этом составляет 30- 40 мин вокруг цилиндров.

Единичные колонии, выросшие в этой зоне, отбирают и проверяют их фибри- нолитическую активность.

Пример 3. Культуру штамма Str.spheroides № 35 выращивают на синтетических средах в аэробных условиях при 28°С на круговой качалке с 200-220 об/мин в колбах на 750 мл с объемом среды 100 мл; Из культуральной жидкости методом, аналогичным примеру 1 и 2, выделяют протеолити- ческий ферментный комплекс. Полученный ферментный раствор вносят в стерильные металлические цилиндры из нержавеющей стали в концентрации 5 мг/мл по белку. Дальнейшие операции с опорами стрептомицета аналогичны примеру 1 и 2. Диаметр зоны подавления роста культуры на чашках Петри составляет 15-20 мм вокруг цилиндров с ферментом. Так как зона мала, то выросшие колонии из нее практически отобрать невозможно.

Таким образом, оптимальная концентрация вносимого ферментного раствора составляет 10 мг/мл, увеличение концентрации ферментного раствора до 15 мг/мл, связанное с большим расходом фермента, не дает увеличения зоны подавления роста, уменьшение же концентрации до 5 мг/мл ведет к значительному уменьшению величины диаметра зоны подавления роста, что делает отбор невозможным.

(Формула изобретения

Способ отбора мутантов Strepto- ш/ces spheroides - продуцентов экзо- г.ротеазы с фибринолитической активностью, предусматривающий обработку штамма S.spheroides № 35 ультрафиолетовым светом с последующим высевом спор на селективную среду, отличающийся тем, что, с целью упрощения отбора и повышения выхода фермента, споры высевают на среду, содержащую экзопротеачу H:I S.spheroides в концентрации 5-15 мг/мл.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение отбора и повышение выхода ферментов, Способ заключается в том, что споры Streptomyces spheroides штамм № 35 обрабатывают Ультрафиолетовым светом и высевают на агаризо- ванную среду, содержащую экзопротеа- зы S.spheroides с фибринолитической активностью в концентрации 5-15 мг/мл. с S