Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага Т7. Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы.

Целью изобретения является получение штамма гибридома, продуцирующего моноклональные антитела(Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.

Штамм получают следующим образом.

Восьминедельных мышей линии BALB/C иммунизируют в пятки задних

лап по 35 мкг антигена с полым адь- ювантом Фрейнда. Через 4 нед. мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи, туловища 50 мкг антигена в неполном адьюван- те Фрейнда. По истечении 4 нед. вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинно без адьюванта. Через 10 дней неиммунных мышей линии BALB/C летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, а через 24 ч после облучения им внутривенно вводят лимфоел

05

иты, полученные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкла- ывают по 30 мкг антигена внутрибрю- ганно. Четыре дня спустя после трансплантации лимфоцитов ставят слияние.

Титр антител, специфичных и ДНК - зависимой РНК-полимеразе б актериофа™ а Т7, составляет в сыворотке под- пытной tMbrniH 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммунофер- ентиого анализа.

Слияние сштеноцитов с клетками ышиной миеломы лгшии Х63.АГ8.653 проводя т с помощью ПЭГ фирмы Merk (ФРГ) с мол.массой 4000. Отношение числа клеток миеломы к числу сплено- итов составляет 1:1. После слияния летки вносят в лунки 96-луночных панелей. За 1 сут до слияния в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (1 млн.кл/мл, по 1000 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов проводят на среде ГАТ (Litllefield, I.n. Science, 1964, v. 145, p. 709-710), приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Клетки культивируют в инкубаторе с 6%-чым содержанием COg, в атмосфере. Клоны гибридных клеток появляются через неделю в 60% лунок.

Через 14-17 дней тестируют куль- туральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специальных антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализ а.

Клонирование положительных культур проводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на одну лунку 96-луночного плэйта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон ИМБ-4СЗ отобран как лучший продуцент моноклональных антител я повторно клонирован по описанной схеме. Один из реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100% привитых мышей BALB/C, назван ИМБ-4СЗ,

Штамм клеток ИМБ-4СЗ депонирован во 4 ВсеcoraaKoftf.коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(II) $ 850D. - Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Суспензионная культура, состоящая из круп- иых округлых клеток с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы. Ядрышки крупные по 1-2 в ядре. .

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда ДМЕМ, сыворотка эмбриона коровы (10%), сыворотка новорожденных телят (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол

(0,05 ммоль), пенициллин/стрептоци- мин (1000 ед./мл). Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия- встряхивание. Частота пассирования - 2-3 раза в неделю. Посевная доза

,. 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.

Контаминация.Бактерии, грибы и ми- коплазмы не обнаружены.

Культивирование in vivo. Культура

прививается и растет в виде асциты в перитональной полости мышей BALB/C. За 7 дней до введения клеток мышам- реципиентам вводят по 0,5 мл приста- на. Асцит образуется через 10-14 сут

5 после введения 1-5 млн,клеток.

Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона

ЙМБ-4СЗ интенсивность продукции антител не изменилась (титр антител по SLISA в культуральной среде 10 , а в асцитической жидкости 3x1 ОО. Мон AT относится к классу иммуноглобулинов G1.

Ь Консервация клеток. Клетки ИМБ-4СЗ заморожены на 36-м пассаже. Общее ко- личество ампул 20, по 4 млн. клеток в ампуле. Криозащитная среда - рос- , товая среда с 50-60%хэмбриональной

телячьей сыворотки и 10% диметилсуль- фоксила. Выживаемость при размораживании 95%.

Приме р 1. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4СЗ.

Во флаконы для культивирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200 тыс. клеток в.1 мл среды ДМЕМ, содержащей эмбриональную сьгооротку коровы (10%), сыворотку

новорожденных телят (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль), пе- ницилин/стрептомицин 1000 ед. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном

5 состоянии при 37°С в атмосфере 6% COg. Концентрация клеток, превышающая 1 млн. в 1 мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их ги

51

бель. Культуральную жидкость из флаконов с 3-дневной культурой тестируют на присутствие Мон AT. При посеве клетки встряхивают, разбавляют ростовой средой до указанной концент- рации и разливают по флаконам.

Пример2. Культивирование гиб ридомных клеток ИМБ-4СЗ.

Клетки, растущие в культуральных флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Клетки должны быть в концентрации, не превышающей 500 тыс./мл, т.е. находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный остаток после центрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Доводят концентрацию клеток до 1-Ю млн/мл и вводят в брюшную полость мышей BALB/c, предварительно обработанных пристанем. Обработку проводят однократно за 1- 3 недели до введения гибридомных клеток путем инъекции 0,5 мл пристава. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуются асцитные опухоли у 100% привитых мышей BALB/C. Количество асцитной жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей после введения им гибридомных клеток ИМБ-4СЗ (в среднем 20 животным), составляет 5 мл. Содержание Мон AT в 1 мл асцитной жидкости составляет 10-20 мг.

Приме р 3. Использование моно- клональных антител ИМБ-4СЗ в иммуно- ферментном анализе.

Для определения активности взаимодействия ИМБ-4СЗ с антигенными детер

10

15

20

01

5

0

5

0

566

минантами ДНК-зависимой РКК-полиме- разы бактериофага Т7 применяют метод непрямого твердофазного анализа. В качестве твердой фазы используют 96-луночные пластинь., сенсибилизированные РНК-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл (раствора на лунку). Далее в лунки пластин вносят по 100 мкл раствора ас- тической жидкости в необходимом разведении - в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мМ NaCl, pH 7,4 (ЗФР). Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до 0,1% детергента Твин-20 и до 0,2% бычьего сывороточного альбумина (ЭФР-АТ). Пластины инкубируют 1 ч при 37°С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащим 0,05% детергента Твин-20 (ЗФР-Т). После этого в лунки вносят по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулина мыши с пероксидазой хрена и инкубируют 1 ч при 37°С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат 0,005 М 2,2-азиноди-(13-этилбензтиазолин-6- сульфонат) (Н)й и 0,01%-ный HЈ02 в 0,05 М цитратном буфере (.рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus .tnusculus L, BCKK(lI)-350D, используемый для получения моноклональных антител к ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага 17.

Изобретение относится к гибри- добной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией сплено- цитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы бактрериофага Т7 с клетками мышиной миеломы линии Х63. АГ8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом