Способ получения рестриктазы AI и I Советский патент 1989 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/06 

(21) 4194840/28-13 (22) 16.02.87 (46) 07.01.89. Бюл. № 1 (7.1) Научно-производственное объединение Бислар и Всесоюзный научно- исследовательский институт молекулярной биологии

(72) М.Я.Хейслере, С.Х.Дегтярев, Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин и Н.А.Божко (53) 577.15(088.8)

(.56) Roberts R.J. Myers P.А., Morrison А., Murray К.А. Specific endonuc- lease from Arthrobacter luteus.- J. Molec. Biol., 1976, V. 102, № 1 P. 157-165.

Clarke C.M., Hartley B.C. Purification, properties and ,specifity of the restriction endonuclease from Bacillus stearothermophilus.- Bio- chem, J., 1979, v. 177, p. 49-62.

George J., Chrikjian I.e. Biospe- cific fractionation matrix for seg- nence - specific endonucleases.- Nucleic Acids Res., 1978, v. 5. p. 2223-2232.

Green P.J., Heyneker H.L.et al. A general method for the purification of restriction enzymes.- Mud. Ac, Res., 1978, V. 5, N 7, p. 2373-2380.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ Alul. ,

(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения рестриктазьк Alul из клеток бактерий: Arthrobacter luteus. Целью изобрете- ния является повьшение стабильности рестрнктазы Alul и увеличение вькода целевого продукта. Разрушение клеток проводят в присутствии 6-8%-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического растворителя используют толуол при объемных соотношениях яичного масла и толуола (1,0:12,0)- (1,0:16,0). В результате использования предлагаемого изобретения выход рестриктазы Alul.составляет 10000- 15000 ед/г биомассы. 2 табл.

W

4

(;о

ел

00

IN9

Изобретение относится к химическо п|ромьп1шенности, касается способа по- л|учения .рестриктазы Alul из клеток бактерий Arthrobacter luteus.

Цель изобретения - повышение стабильности рестриктазы Alu1 и увеличение выхода целевого продукта, °

Способ предусматривает разрушет:. Яие клеток в присутствии 6-8%-ного ipacTBopa яичного масла в толуоле, в лиэате сохраняется 90% активности ре стриктазы Alul. При разрушении клето только в присутствии толуола в лиза- 16 сохраняется 60% активности реет- риктазы Alul J т.е. в 1j5 раза меньше чем при добавлении 6-8%-ного раствор яичного масла в толуоле. I Яичное масло получают из желтка куриньк яиц. Яичное масло имеет сле- ;ующий состав, %: липиды 60, этило- Еый спирт 15, вода 25. Липиды включа нт большую и крайне ..разнородную группу веществ лецитин, кефалин, ариглицериды, холестерин и др, I Пример 1. Юг биомассы Air- tjbrobacter luteus ВКПМ . В-3670 :.раз- ораживают и суспендируют в 20 мл ра очего буфера .(, 0,01М,, 752-7,6; 2-меркаптоэтанол. Os6lM).

К 30 мл суспензии добавляют 5 мл раствора яичного масла в то- Луоле. Отношение яичного масла к то- Луолу 1,0:12,0, Во время разрушения ijuieToK температуру суспензии поддер- з|сивают на уровне 1 2° С, Обрабатывают фуспензию ультразвуком 5-10 с 2тЗ jfasa,

Обработанную ультразвуком микроб- ую массу центрифугируют на Центрифу i e High ppeed (10000 х g, 30 мин). После центрифугирования отбирают фодньй слой и наносят на колонку с фосфоцеллюлОзой. (V. 40 см) уравно ешенную рабочим буфером

Фракции, содержащие рестриктазу ф.лц1, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диали.зируют про- тив 1 л диализной смеси в течение 12 ч.

Состав диализной смеси глицерин 50% , трис-HCl 10 мМ, рН 7,4; КС1 50 мМ. ,

Выход рестриктазы Alu1 150000 ед/ /10 мл, активность 15000 ед/мл., вы- 5сод 15000 ед/г биомассы.

0

5

0

5

0 5

«

Для измерения активности рестриктазы Alu1 используют метод электрофореза в геле.

За единицу активности рестриктазы Alul принимается количество фермента, достаточное для полного расщепления 1 мкг ДНК фага -Д за 1 ч при 37 С.

П р и м е.р 2. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют 5,0 мл 7%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,,X). Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alul проводят аналогично примеру ,1 .г

Выход рестриктазы Alul 125000 ед/ /10 мл, активность 12500 ед/мл, выход 12500 ед/г биомассы

П р и м е р 3. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии ..добавляют 5,0 мл ..6%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0:16,0. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктазы Alul проводят аналогично примеру 1,

Выход рестриктазы Alul 100000 ед/ /10 мл, активность 10000 ед/мл, вы-- ход 10000 ед/г биомассы.

Приме р4 Суспендирование- биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии дoбaвляюt 5,0 мл .5%-ного раствора, яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0:19, О. Дезинтеграцию клеток и последунлцее вьзделение рестриктазы Alul проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 50000 ед/ /10 МП, активность 5000 ед/мл, выход 5000 ед/г биомассы.

П р и м е р 5, Суспевдирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют 5 мл 9%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,0:10,0. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктазы Alul проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 53000 ед/ /10 мл, активность 5500 ед/мл, выход 5500 ед/г биомассы.

Приме р6. Юг биомассы Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (трис-HCl ,0,01М, рН 7,2-7,6; 2-меркаптоэтанол 0,01М). К 30 МП суспензии добавляют 5 мл концентрированного толуола. Во время разрушения клеток температуру суспен- зии поддерживают на уровне Обрабатывают суспензию ультразвуком 5-10 с 2-3 раза.

Обработанную ультразвукбм микроб- ную массу центрифугируют на центрифуге High speed -(10000 X g, 30 мин).

После центрифугирования отбирают водный слой и наносят на колонку с

Выход рестриктаз г Alul 75000 ед/ /10 мл, активность 7500 ед/мл, выход 7500 ед/г биомассы .

В примерах 4-8 иллюстрируются запредельные значения параметров.

Данные, полученные в результате вьщеления рестриктазы Alul из штамма бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 с использованием разных спосо бов, представлены в табл. 1.

Пример 10. Для вьщеления рестриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

фосфоцеллншозой (V 40 см) уравно- 15 ° ™ вешенную рабочим 6v benoM Размораживание биомассы, девешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу Alul, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе. , .

Активные фракции диализируют против 1 л диализной с)иеси в т еченйе 12 ч.

Состав диализной смеси: глицерин 50%, трис-НС 10 мМ, рН 7,4; КС1 50 мМ.

Выход рестриктазы Alul 100000 ед/ /10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.

П р и м е р 7. Суспендирование проводят аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавляют 4 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктаэы Alu1 проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 83000 ед/ /10 МП, активность 8300 ед/мл, выход 8300 ед/г биомассы.

П р и м е р 8. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. К 30 мл. суспензии добавляют 3 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alul проводят . аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 66000 ед/ /1б мл, активность 6600 ед/мл, выход

25

30

,6600 ед/г биомассы.

Пример 9. Суспендирование биомассы проводят аналогично примеру 1. 30 мл суспензии обрабатывают

зинтеграцию клеток и вьщеление фермента проводят аналогично примеру 1. Выход рестриктазы Alul 80000 ед/ /10 мл, активность 8000 ед/мл, выход 20 800 ед/г биомассы.

П р и м .е р 11. Для выделения ре- стриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-1777. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьщеление фермента проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы. Alul 40000 ед/ /10 мл, активность 4000 ед/мл, выход 4000 ед/г биомассы.

Данные, полученные в результате .. вьщеления рестриктазы Alul из разных штаммов бактерий Arthrobacter luteus с использованием различных способов, представлены в табл. 2. 35 Из табл. 2 видно, что при вьщеле- нии рестриктазы Alu1 из разных бактериальных штаммов Arthrobacter luteus происходит увеличение активности и выхода фермента по сравнению с из- 40 вестным способом.

Формула изобретения Способ получения рестриктазы Alul, включающий разрушение клеток Arthrobacter luteus, фракционирование полу

45 ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией и диализом, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности рестриктазы Alul и увеличения

50 выхода целевого продукта, разрушение клеток проводят в присутствии стабилизатора - 6-8%-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического растультразвуком 5-10 с, 2-3 раза. После- 55 ворителя исполь;;юГ;;;;о Г;;Гоб:Г;: Рестриктааь, Alu I ньпс соотношениях яичного масла и то- проводят аналогично примеру 1. луола 1,0:12,0-1,0:16,0.

1449582

Выход рестриктаз г Alul 75000 ед/ /10 мл, активность 7500 ед/мл, выход 7500 ед/г биомассы .

В примерах 4-8 иллюстрируются запредельные значения параметров.

Данные, полученные в результате вьщеления рестриктазы Alul из штамма бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 с использованием разных способов, представлены в табл. 1.

Пример 10. Для вьщеления рестриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

° ™ Размораживание биомассы, де15 ° ™ Размораживание биомассы, де25

30

зинтеграцию клеток и вьщеление фермента проводят аналогично примеру 1. Выход рестриктазы Alul 80000 ед/ /10 мл, активность 8000 ед/мл, выход 20 800 ед/г биомассы.

П р и м .е р 11. Для выделения ре- - стриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-1777. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьщеление фермента проводят аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы. Alul 40000 ед/ /10 мл, активность 4000 ед/мл, выход 4000 ед/г биомассы.

Данные, полученные в результате .. вьщеления рестриктазы Alul из разных штаммов бактерий Arthrobacter luteus с использованием различных способов, представлены в табл. 2. 35 Из табл. 2 видно, что при вьщеле- нии рестриктазы Alu1 из разных бактериальных штаммов Arthrobacter luteus происходит увеличение активности и выхода фермента по сравнению с из- 0 вестным способом.

Формула изобретения Способ получения рестриктазы Alul, включающий разрушение клеток Arthrobacter luteus, фракционирование полу

5 ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией и диализом, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности рестриктазы Alul и увеличения

0 выхода целевого продукта, разрушение клеток проводят в присутствии стабилизатора - 6-8%-ного раствора яичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического раст5 ворителя исполь;;юГ;;;;о Г;;Гоб:Г;: ньпс соотношениях яичного масла и то- луола 1,0:12,0-1,0:16,0.

Таблица 1

Arthrobac- ter luteus ВКПМ B-3670 15000

15000 10000 10000 7500

2U

7500

Таблиц a 2