Питательная среда для выращивания АRтнRовастеR LUтеUS - продуцента рестриктазы AI и I Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 C12N1/20 C12R1/06 

(21) 4194876/28-13 (22) 13,02.87 (46) 07.01.89. Бкш. № 1

(71)Научно-производственное объединение Биолар и Всесоюзный научно- исследовательский институт молекулярной биологии

(72)Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин, Н.А.Лож- ко, З.А. Виестуре и М.Я.Хейслере (53) 577.15(088.8)

.(56) Авторское свидетельство СССР № 1095642, кл. С 12 N 9/14, 1982.

Qreeh P.J., Heyneker H.L., Bolivar F. et. al. A generate method for the purification of restriction enzymes.- J. Nucl. Ac. Res. 1978, 5, № 7, p. 2373-2380.

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАП|И- ВАНИЯ ARTHROBACTER LUTEUS - ПРОДУ ЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ Alul (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается состава питательных сред для выращивания Arthrobac- ter luteus - продуцента рестриктазы Alul. Целью изобретения является повышение выхода рестриктазы Alul и удешевление целевого продукта. Изобретение заключается в том, что питательная среда содержит в качестве источников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов в количестве 45- 50 г/л, что обеспечивает создание высокоэффективной, питательной среды, в которой созданы условия накопления рестриктазной активности и роста Arthrobacter luteus. Выход рестриктазы Alul возрастает до 10000- 15000 ед/г биомассы. 2 табл.

о 6

(Л

4 4 СЛ Kj

Изобретение относится к биотехно- лоЫи и касается состава питательных для выращивания Arthrob cter luteus - продуцента рестриктазы Alul

Цель изобретения - повышение выхода рестриктазы Alul и удешевление целевого продукта.

Изобретение предусматривает ис. по|пьзование белкового гидролизата по|пученного из. отходов трески (голова и внутренности). В мозгу трески содержится 7-9% белка от свежей ткани, в селезенках - 17-18%, почках - 16-17%, сердце - 16-18%. Кроме того, указанные отходы богаты витаминами (Bjy.-. , фолиевой кислотой, параамино- бе|нзойной кислотой, биотином), которые необходимы для нормального раз- бактерий.

Предлагаемое техническое решение

об

гспечивает повьшгение выхода рестэиктазы Alul с 80 ед/г биомассы до ЮРОО-15000 ед/г биомассы.

Морфологически Arthrobacter luteus 25

ыо

время развития претерпевает изме

, т.е. молодая культура имеет фо|рму папочек, которые по мере обед- не|ния среды питательными веществами и Обогащения продуктами метаболизма постепенно переходят в форму кокков. Ко|ккообразные клетки Arthrobacter luteus прекращают биосинтез рестрик- тары Alu 1 . Введение в питательную среду белкового гидролизата из рыбны отходов способствует продлению лога- ритмической фазы роста и предотвращает раннее старение культуры.

I рН белкового гидролизата из рыб- Hbjx отходов 7,2-7,4. При растворении ег|о в воде рН не меняется. Оптималь- нь|м рН для Arthrobacter luteus являемся значение 7,2-7,4. Таким образом от падает необходимость при приготовлении питательной среды добавлять 1 слоты или щелочи, которые отрицательно влияют на биосинте рестриктазы Alu 1.

Пример 1. Питательная среда

содержит, г/Л

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески 50,0 Глицерин4,О

Вода, лДо 1,О

Культуру А. luteus ВКПМ-3670 предва|рительно адаптируют на сухом пита

0

0

5

0

5

тельном агаре в чашках Петри при 35- 37 С в течение 16-18 ч.

Инокулят готовят, пересевая культуру бактериологической петлей в ка- чалочные колбы (250 мл питательной среды данного состава в каждой) и размножают в условиях аэрации при 35-37°С в течение 14-16 ч. Посевной материал готовят из расчета 5% по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферментатор.

Ферментацию культуры проводят на данной питательной среде при 35-37 с, при подаче воздуха 1 объем воздуха: :1 объем питательной среды, перемешивании 200-250 об/мин. Выращивают до оптической плотности суспензии клеток 0,9-1,2 опт. ед. (ФЭК, 550 нм, кювета 0,5 см), что соответствует поздней логарифмической фазе (по калибровочной кривой),

Выход биомассы 9,0 г/л культураль- ной жидкости.

Выделение фермента можно проводить двумя методами.

Метод 1. 10 г биомассы бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (0,01 М трис-НС1, рН 7,,6; 0,01 М 2 меркаптоэтанол),

К 30 МП суспензии добавляют 5 мл 8%-ного раствора яичного масла в толуоле. Отношение яичного масла к толуолу 1,,0. Во время разрушения клеток температуру сз спензии поддерживают на уровне С. Обрабатьюают суспензию ультразвуком 5-10 с, 2- 3 раза.

Отработанную ультразвуком микробную массу .центрифугирзтот на центрифуге High .speed (10000...Х g, 30 мин).

После центрифугирования отбирают водный слой и наносят колонку с фос- фоцеллюлозой (V 40 см), уравновешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу Alul, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диализируют против 1 л диализной смеси в течение 12 ч..

I

Состав диализной смеси: глицерин

50%, трис-HCl 10 мМ, рН 7,4, КС1 50 мМ.

1449579

Для определения активности рест- риктазы Alul используют метод электрофореза в геле.

За единицу активности рестриктазы Alul принимают количество фермента, достаточное , для полного расщепления 1 мкг ДНК фага за 1 ч при 37°С. Выход рестриктазы Alu 150000 ед/

Глицерин

Вода, лДо

Выращивание биомассы. Адаптац культуры, инокуляцию посевного м риала, ферментацию культуры пров аналогично примеру 1,

Выход биомассы 8,0 г/л культу ной жидкости, выход рестриктазы

4 о п j /

, - V-M, лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы lnnT 15000 ед/ш1, выход 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л оиии ед/г бипмяггм.„,.„.л.

15000 ед/г биомассы.

Метод 2. Размороженную биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 (50 г) суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-НС буфера, рН 7,2, содержащем 10 мМ 2-мерк-аптоэтанол, 1 мМ азид натрия, 1 мМ трилон Б (буфер А) и доводят этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мп 10%-ного тритона Х-100 и 150 мг ли- аоцима. Лизис проводят 1 ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лизат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного .. водного раствора полиэтилен гликоля и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге High speed (20000 х g, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двукратным объемом буфера А, добавляют тритон Х-100 (0,1%) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержапщм 0,1%-ный тритон Х-100 (буфер Б). Фермент элюи- Q руют 0-1,0 М линейнь1М градиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Alul, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55%-ный глицерин.

Выход рестриктазы Alul 525000/ /50 МП, активность 10500 ед/мл, выход рестриктазы Alul 10500 ед/г биомассы;

30

культуральной жидкости.

П р и М е р 3. Питательная сре содержит, г/л:

Белковый гидролизат из 15- рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0

Глицерин3 О

Вода, лДо

20 Выращивание биомассы. Адаптаци культуры, инокулдцию посевного ма риала, ферментацию культуры про во аналогично примеру 1.

Выход биомассы 7,0 г/л культур 25 ной жидкости, выход рестриктазы A 10000 ед/л биомассы, 700000 ед/л культзфальной жидкости.

П р и М. е р 4.(иллюстрирует за дельные значения параметров). Пит тельная среда содержит, г/л: Белковый гидролизат из рыбных отходов, получаемы при переработке трески 45 Глицерин2

Вода, лДо 1

Вьфащивание биомассы. Адаптацию культуры, инокуляцию посевного мат риала, ферментацию культуры провод аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,0 г/л культура ной жидкости, выход,.рестриктазы Ai 5500 ед/г биомассы, 16500 ед/л кул туральной жидкости.

П р и М е р 5 (иллюстрирует зап 45 дельные значения параметров). Пита тельная среда содержит, г/л: Белковьш гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески Глицерин Вода, л

35

52,5 .5 До 1,

По данным электрофореза препарат фермента не содержит детектируемых . примесей неспецифических эндонуклеаз.

П р и М е р 2. Питательная среда содержит, г/л:

Белковьй гидролизат из рыбных отходов, получен- .ных при переработке трески 47 5

Глицерин3 5 о

Вода, лДо До

Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1,

Выход биомассы 8,0 г/л культураль- ной жидкости, выход рестриктазы Alul

4 о п j /

лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л „,.„.л.

лчидлииги, ВЫХОД рестриктазы 12500 ед/г биомассы, 100000 ед/л „,.„.л.

Q

30

культуральной жидкости.

П р и М е р 3. Питательная среда содержит, г/л:

Белковый гидролизат из 15- рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0

Глицерин3 О

Вода, лДо

20 Выращивание биомассы. Адаптацию культуры, инокулдцию посевного материала, ферментацию культуры про воддт аналогично примеру 1.

Выход биомассы 7,0 г/л культураль- 25 ной жидкости, выход рестриктазы Alul 10000 ед/л биомассы, 700000 ед/л культзфальной жидкости.

П р и М. е р 4.(иллюстрирует запредельные значения параметров). Питательная среда содержит, г/л: Белковый гидролизат из рыбных отходов, получаемы при переработке трески 45,5 Глицерин2 5

Вода, лДо 1, о

Вьфащивание биомассы. Адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,0 г/л культуральной жидкости, выход,.рестриктазы Aiul 5500 ед/г биомассы, 16500 ед/л культуральной жидкости.

П р и М е р 5 (иллюстрирует запре- 45 дельные значения параметров). Питательная среда содержит, г/л: Белковьш гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески Глицерин Вода, л

35

0

52,5 .5 До 1,0

Выращивание биомассы. Адаптацию gg культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культ.уры проводят аналогично примеру 1.

Выход биомассы 3,5 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Alul,

lA

5000 ед/r биомассы, 17500 ед/л куль- тур|альной жрщкостй.

Данные выращивания штаммов - продуцентов рестриктазы Alul на .предла- гаеИой питательной среде приведены в т|абл. 1.

Данные вьфащивания штаммов - про- (гнтов рестриктазы Alu1 на известДУ.Ц ной таб.

i|i. 2.

Из табл. 1 И 2 видно, что при выращивании различных штаммов - прсду- цен

питательной среде приведены в

РОВ рестриктазы Alul на предлагаемой питат(2льной среде происходит уве- 15 лич эние выхода . би-омассы и рестрик- тази по сравнению с результатами, по- лучгнными с использованием известной ср-еды. Формула изобретения 20

Питательная среда для выраа1ивания Artl.robacter luteus - продуцента ре495796

стриктазы Alul, содержащая в качест-, ве источника углерода гтгицернн, источники аминного азота, витаминов, микроэлементов и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода рестриктазы Alul и удешевления целевого продукта, в питат тельную среду вводят в качестве источников аминного азота, витаминов и микроэлементов белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески, при следующем соотношении компонентов, г/л среды:

10

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0-50,0

Глицерин . 3,0-4,0 .Вода, лДо 1,0

Artihrobacter lu-Белковый гидролкг

teuis ВКПМ В-3670зат из рыбных отIходов 45,0-50,0

Artprobacter lu-Глицерин 3,0-4,0

tevss ВКГШ В-1810Вода, до 1,0 д

Artjhrobacter luteuis ВКПМ. В-1777

Arthrobacter lu- Триптон 11,0 г/л teius ВКПМ В-3670 дрожжевой экстракт

22,5 г/л

Arthrobacter lu- 1М КдНР04 51 мл, tevs ВКШ- В-1810 1М 15,7 мл Arthrobacter lu- Глицерин 4,0 мл, tens ВКга-1 В-1777 Вода до 1,0 л

ВНШШИ Заказ 6934/28

Произв.-полигр. пр-тне, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Белковый гидролизат из рыбных отходов, полученных при переработке трески45,0-50,0

Глицерин . 3,0-4,0 .Вода, лДо 1,0

Таблица 1

10000- 15000

70000- 135000

7000-8000 28000- 40000

3000-4000 12000- 20000

Таблица2

6300-7500 23625-33750 4000-5000 8000-12500 1500-2000 3000-5000

Тираж 520 Подписное