Способ получения биомассы MIcRococcUS LUтеNS ВКПМ В-2836 продуцента рестриктазы MLU 1 Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биомассы для производства эн- донуклеазы рестрикции.

При получении рестриктаз важным этапом являются стадии оптимизации селекции и культивирования штаммов-продуцентов с целью достижения более высокого выхода изучаемых ферментов.

Выход рестриктаз и неспецифическое нуклеазное загрязнение в значительной мере обусловлены составом питательной среды и условиями выращивания штамма-продуцента.

Эти данные свидетельствуют об отсут- СТЁИИ обобщенной теории биосинтеза рестриктаз, что обуславливает эмпиричность в подборе условий культивирования штам- мов-лродуцентов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы

Micrococcus luteus, вклвдяающий выращива-. ние культуры при 37° с интенсивной аэрацией в среде, содержащей, г/л воды: бактопептон 10; дрожжевой экстракт 5; NaCI 5; глюкоза 1, до оптической плотности А260 1. Выход биомассы .с 1 л среды 4 г. Выход фермента из 1 г клеток после двух хроматографических стадий (фосфоцеллю- лоза Р-11 и ДЕАЕ-целлюлозаДЕ-52)800ед. акт.

Недостатком известного способа является низкое содержание рестриктазы Mlu I в биомассе.

Цель изобретения - повышение содержания рестриктазы Mlu I.

Поставленная цель достигается тем. что способ получения биомассы Micrococcus luteus ВКПМ В-2836 - продуцента рестриктазы Mlu I предусматривает приготовление посевной культуры на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК из тиNJсо

OQ ОС СЛ Ы

муса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, последующий селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu I и минимальным загрязнением неспецифическими иуклеазами, засев отобранным клоном жидкой питательной среды и выращивание в оптимальных условиях.

При реализации этого способа достигается уровень содержания фермента Mlu в грубом экстракте клеток 12000-15000 ед. акт./г влажных клеток. После проведения двух стадий очистки (фосфоцеллюлоза Р-11 и ДЕ АЕ-целлюлоза ДЕ-52) из 1 г клеток получают 10000-12000 ед. акт. очищенного фермента Mlu I. В качестве контроля проводят пассирование и селекцию посевного материала на средах без ДНК и с добавлением ДНК в различных концентрациях.

Результаты опытов представлены в таблице.

Проведены следующие исследования:

анализ клонов на содержание рестриктазы Mlu I при пассировании на средес ДНК (первая дорожка - 5 мин инкубации, вторая - 30 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага лямбда);

анализ клонов на содержание рестриктазы Mlu I при пассировании на среде без ДНК (контроль, первая дорожка - 5 мин инкубации, вторая - 60 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мк ДНК фага ламбда);

анализ биомасс М. luteus на содержание рестриктазы Mlu I, полученных с пассированием на среде без ДНК, с пассированием на среде с ДНК. В пробы добавляли соответственно клеточного лизата 0,5(а); 1,0(6); 2,0(в); 3,0(г); 5,0(д); 10.0(е): 0,025(ж); 0,05(3); 0.1 (и); 0,15(к); 0,25(л) и 0,75(м) мкл, инкубировали с 0,5 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37°С.

Из полученных данных установлено, что картина полного специфического гидролиза ДНК рестриктазой наблюдается в первой биомассе на дорожке в, что соответствует содержанию фермента 1000 ед. акт./r клеток, во второй - на дорожке к, что соответствует содержанию фермента 13500 ед. акт./г клеток (т. е. выше, чем в первой в 2,0/0,,4 раза). Причем во втором случае при пятикратном избытке (дорожка м) сохраняется картина рестрикции, тогда как в первом при том же избытке {дорожка е) наблюдается размывание фрагментов ДНК,

Пример 1. Пассирование и селекция посевного материала.

Штамм М. luteus (коллекционный номер в ВКПМ В-2836) рассевают на агариэованную среду (рыбный питательный ,агар), содержащую ДНК тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл. Выращивают в течение 18 ч при 37°С. Затем из нескольких отдельных

колоний (из 8-12) отбирают петлей половину материала и переносят в отдельные пробирки, содержащие по 200 мкл буфера для разрушения следующего состава: 100 мМ трис-HCI/ рН 8,0; 50 мМ NaCI; 0,1%-ный

Тритон Х-100; 0,01%-ный лизоцим. Полученные лизаты (после инкубации при 4°С в течение 30 мин) используют для определения количества рестриктазы и неспецифического нуклеазного загрязнения (по реакции расщепления ДНК фага лямбда). Для этого по 5 мкл лизата каждого клона инкубируют с 0,5 мкг ДНК в инкубационной смеси в течение 5 и 30 (60) мин. Затем продукты

расщепления разделяют электрофорезом в геле агарозы. Колонии, содержащие максимальный уровень рестриктазы при минимальном загрязнении неспецифическими нуклеазами, используют для культивирования (контрольный опыт со средой без ДНК

при необходимости, выполняют идентично).

Пример 2. Получение биомассы.

Отобранный клон клеток засевают в 50

мл питательной среды для получения инокулята. После инкубации на качалке при 200- 220 об/мин в течение 18 ч при 37°С полученным инокулятом засевают объем среды (качалочные колбы с 250 мл среды), предназначенный для культивирования, из

расчета 1 мл инокулята на 100 мл среды. Инкубируют в тех же условиях в течение 18 ч. Затем после охлаждения клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин. Выход биомассы: 4,1-4,3 г с 1 л среды. Содержание фермента 12000-15000 ед. акт./г влажных клеток.

Формула изобретения Способ получения биомассы

Mlcrococcus luteus ВКПМ В-2836 - продуцента рестриктазы Mlu I, предусматривающий приготовление посевной культуры на твердой питательной среде, содержащей добавку, засев ею жидкой питательной среды, выращивание в оптимальных условиях, отделение клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания рестриктазы, посевную культуру готовят на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл среды, и перед засевом проводят селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu I и минимальным загрязнением неспецифическими нуклеазами.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения; проводят предварительное пассирование посевного материала на агаризованной среде, содержащей ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, и селективный отбор наиболее продуктивных клонов бактерий путем анализа их на содержание целевого фермента. Способ озволя- ет в 12-15 раз повысить содержание целевого фермента в биомассе. 1 табл. If, С