Способ получения эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 @ - TGATCA-3 @ Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается получения сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов б -ТСАТСА-З.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов, расширяет возможность конструирования гибридных молекул по сайту, имеющему в своей основе широко распространенный тетра- нуклеотид 5 -САТС-3 .

Известен способ получения рестриктаз Bst GI (сайт узнавания б -ТСАТСА-З) и Bst Gil (сайт узнавания 5 -ССА/Т6С-3)из штамма Bacillus stearothermophllus G3.

Недостатком данного способа является наличие двух активностей, что затрудняет получение чистого фермента, узнающего и расщепляющего последовательность нуклеотидов 5 -TG АТС А-3

Известен способ получения рестрикта- зы Bsp XII (сайт узнавания s -TGATCA-З ) и Bsp XI (сайт узнавания 5 -ATCGAT-J), включающий в себя культивирование штамма

4 N3 N О 00 Ч)

Bacillus sphaerlcus, хроматографические стадии очистки.

Недостатком данного способа является невысокий выход фермента Bsp XII, который составляет приблизительно40000 ед./г сырой биомассы. Кроме того, наличие двух ферментов усложняет процедуру очистки и получения целевой рестриктазы без интерферирующего загрязнения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения рестриктазы Bel I, узнающей и расщепляющей сайт 5- TGATCA-3 , включающий в себя использова- ние штамма - продуцента Bacillus caldolyticus, культивирование его для получения биомассы, многократную дезинтеграцию биомассы, выделение и очистку рестриктазы хроматографическим способом.

Недостатками известного способа являются низкий выход целевого фермента (40000 ед./r сырой биомассы) и низкая активность фермента {1 ед./мкл), а также прочность клеточной стенки штамма затрудняет разрушение биомассы и требует многократной дезинтеграции.

Целью изобретения является увеличение выхода и активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения рестриктазы в качестве продуцента используют штамм Bacillus stearothermophilus (ВКПМ В-5209).

Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов биологически активных веществ.

Полученный штамм Bacillus stearothermophilus депонирован в ВКПМ ВНИИгенетики под регистрационным номером В-5209, а продуцируемая им рестрик- таза названа Bst 77 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus stearothermophilus характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые или слегка изогнутые (0,5-0,75) х (2-14) мкм, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, терминального расположения, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму вариабельная.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие круглые, непигментированные колонии, прозрачные, блестящие, с ровным краем. Оптимальная температура роста 65°С, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе, в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидроли- зует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет при

концентрации NaCI 5% и 0,001 % лизоцима; энергично образует кислоту из глюкозы, очень слабо - из арабинозы, ксилозы и ман- нита: не дезаминирует фенилаланин, не выделяет индол и сероводород.

Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину, гентамицину, метициллину, сульфатиазолу, линкомицину; менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину, олеандомицину, левомицетину, канамицину, ристомицину, рифампицину; слабо чувствителен к полимиксину; устойчив к стрептомицину.

Для культивирования Bacillus

stearothermophilus В-5209 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65°С и интенсивной аэрации до достижения стационарной фазы роста.

Выход целевого фермента 65000 ед./г

сырой биомассы с активностью 15 ед./мкл.

Отличием предлагаемого способа от известного является использование нового более продуктивного штамма Bacillus stearothermophilus, превышающего по выходу известный более, чем в 1,5 раза, с более высокой активностью выделяемого

целевого фермента, способностью легко ли- зироваться при ультразвуковой дезинтеграции,

Пример. Штамм выращивают в питательной среде следующего состава, г/л:

пептон 10; дрожжевой экстракт 5 (Difco); глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65°С с аэрацией 2 об./мин, а при перемешивании 150 об/мин до стационарной фазы роста.

Клетки собирают центрифугированием при 5000 g и температуре 4 С.

Биомассу весом 5 г загружают в стеклянный химический стакан, добавляют 10 мл 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,0),

содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркапто- этанол (буфер А) с добавлением 0,4 М хлористого натрия, перемешивают при помощи магнитной мешалки до получения гомогенной суспензии, добавляют 6 мг лиэоцима и перемешивают в течение 30 мин.

Суспензию разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе на резонансной частоте 22 кГц.

Озвученную суспензию переносят в стакан, содержащий50 мл ПЭГ-6000(11,2%) и декстран Г-500 (3,5%), помещают на магнитную мешалку и при постоянном перемешивании добавляют 4М раствор Nad до конечной концентрации 0,5 М. Смесь перемешивают в течение 5 мин.

Для разделения фаз суспензию центрифугируют на центрифуге G-21 при 20000 об/мин в течение 10 мин. Полученный гру- бый экстракт (25 мл) разбавляют в два раза буфером Аи наносят на колонку с гидрокси- лапатитом объемом 25 мл. Примесные белки удаляют промыванием буфером А, содержащим 0,2 М NaCI. Элюцию фермента прово- дят линейным градиентом NaCI 0,01-0,25 М концентрации буфером А. Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, фермент разбавляют в 1,5 раза 20 мМ трис-HCt (рН 7,5), содержащим 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный глицерин (буфер В) и наносят на колонку с гепарин-сефа- розой 4В объемом 30 мл. Примесные белки удаляют промыванием буфером В, содержащим 0,2 М NaCI. Фермент элюируют линей- .ным градиентом 0,2-1.0 М NaCI в буфере В. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и диализируют против 50 мМ трис-HCI (рН 7,9), содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,02%-ный тритон Х-100, 60%-ный глицерин.

Выход фермента 65000 ед.акт./г сырой биомассы, активность 15 ед./мкл. Препарат не содержит примесей эндонуклеаз. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 37°С.

Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента (более, чем в 1,5 раза), облегчает выделение и очистку фермента от интерферирующей рестриктазной активности, поскольку используемый штамм продуцирует только одну рестрикта- зу, позволяет повысить активность рестрик- тазы более, чем в 10 раз, а также облегчает разрушение клеточных стенок бактерий при ультразвуковой дезинтеграции.

Поскольку рестриктаза Bs-t 77 I имеет сайт узнавания 5 -TGATCA-3 , идентичный сайту узнавания рестрйктазы Bel I, она может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Способ получения эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов б -ТСАТСА-З включающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Bacillus, дезинтеграцию биомассы, выделение и хроматографическую очистку фермента, о т- личающийся тем, что, с целью увеличения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Bacillus stearothermophilus ВКПМ В- 5209.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является увеличение выхода и повышение активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве штамма - продуцента Bacillus stearothermophilus(BKnM B-5209), имеющего легко разрушаемые ультразвуком бактериальные стенки и содержащего только одну рестриктазу, что позволяет увеличить выход целевого фермента в 1,5 раза, облегчить выделение и очистку фермента. Выход фермента 65000 ед./r биомассы, активность 15 ед./мкл. Рестриктаза Bst 77, полученная по предлагаемому .способу, является изоши- зомером Bel I и может полностью заменить ее во всех генно-инженерных работах. (Л С