Штамм бактерий РSеUDомоNаS SтUтZеRI - продуцент рестриктазы PSU I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы Psu J,

Цель изобретения - получение штамма Pseudomonas stutzeri (131) ВКПМ В-4727, обладающего более высоким уровнем синтеза рестриктазы, узнающей палиндромную

б ССАтЪзЗ1 последовательность -,г и являю3 GqjAGC5

щейся гомогенно чистой.

Штамм Pseudomonas stutzeri (131) ВКПМ В-4727 выделен из почвы с последующим отбором вариантов, имеющих высокую продуктивность рестриктазы Psu 3. Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Клетки одиночные, палочковидные, прямые или изогнутые, но не спиральные, размеры 0,5-1 х 1,5-4 мкм, движутся с помощью полярных жгутиков. Грамотрица- тельные.

Физиолого-химические признаки.

Метаболизм дыхательный (ассимилируют глюкозу на среде Хью-Лейфсона по окислительному типу), обладает уреазной и аргининдегидролазной активностью.

Пигментов не содержит, растет при 4- 30°С, не растет при 42°С (оптимальная температура роста 25°С).

Леван из сахарозы не образуется, не разжижает желатину и не гидролизует поли- / -оксибутират, гидролизует крахмал.

В качестве единственного источника углерода может использовать глюкозу, L-ва- лин, ацетат, цитрат и не использует трегалозу, 2-кетоглюконат, мезо-инозит, /9

Os

ел

го

00

-аланин, DL-аргинин. При ассимиляции глюкозы образуется кислота.

Сероводород не образуется, реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, тест с метиловым красным отрицательный.

Фенилпируват не образуется (реакция на наличие фенилаланиндезаминазы отрицательная).

Факультативные аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные.

Культуральные признаки.

Рост на косяках густой, сплошной. Штрих широкий, четко видный. При попадании на твердую среду влаги растет в виде сплошной пленки по всей поверхности. При выращиваний культуры в чашках Петри на твердой среде через 24 ч образуются полу- прозрачные точечные колонии размером 0.1-0.2 мм. Через 38 ч образуются белые, круглые, полупрозрачные, совершенно гладкие, влажные, однородные, выпуклые, блестящие с гладким краем колонии. Размер таких колоний в диаметре 2-2,5 мм. По всей консистенции они являются маслянистыми (подобие сливочного масла}.

Колонии не пигментированы.

Штамм Pseudomonas stutzeri 131 имеет сильный запах при росте на твердой или жидкой среде.

При росте в бульоне образуется обильный осадок.

Хорошо растет на жидкой питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидроли- зата и до 1,0 л воды, рН 7.2-7,4. На такой питательной среде штамм растет при температуре 25-27°С, аэрации 2 объема воздуха на 1 объем питательной среды в течение 5-6 ч. При выращивании штамма на питательной среде данного состава происходит помутнение среды, что свидетельствует о сильном росте культуры. Рост глубинный и пленки на поверхности не образуется. Осадок, состоящий из клеток Pseudomonas stutzeri 131, тягучий, при воздействии на него лизоцимом быстро происходит лизис клеток. Количество осадка обильное, цвет осадка светло-серый.

Штамм фагоустойчив. Не лизируется в присутствии фагов Ch 4A, А , MS 2, Q ft,

Штамм чувствителен к ампициллину в концентрации 25 мкг/мя. Штамм дает выход биомассы 6,0-7,5 г/л культуральной жидкости, имеет выход рестриктазы Psu I 6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости, биосинтези- рует одну сайт-специфическую эндонуклеа- зу Psul, являющуюся гомогенно чистой.

Выращивают культуру на питательной среде известного состава при рН 7,2, температуре 25°С, аэрации 2 объема к 1 объему

питательной среды до поздней логарифмической фазы роста. Выход биомассы 6,0-7,5 л/г культуральной жидкости; выход рестриктазы Psu I 3000-4500 ед/r биомассы

или 18000-33750 ед/л культуральной жидкости.

Сравнение уровней продуктивности штаммов - продуцентов рестриктаз - изо- шизомеров рестриктазы Psu 1 представлены в таблице.

Пример. Штамм бактерий Pseudomonas stutzeri 131 выделен из почвы. Для получения изолированных колоний берут 10 г почвы (из расчета абсолютно сухой)

и взбалтывают с 90 мл воды в течение 5 мин. В дальнейшем используют метод предельных разведений, заключающийся в последовательном переносе 1 мл суспензии в пробирку с 10 мл стерильной воды, хорошо

перемешивают и из данной пробирки 1 мл суспензии переносят во вторую пробирку и т.д. Всего делают 8-9 разведений, из каждого разведения производят посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с твердой

питательной средой, содержащей 3.5% сухого питательного агара и воду).

Все выросшие в чашках Петри колонии изучают микроскопически на наличие биохимических признаков, в том числе на наличие активности рестриктазы Psu I. Полученные колонии Pseudomonas stutzeri в активностью фермента Psu I селекционируют с целью получения наиболее активных вариантов.

Проверку продуктивности штамма бактерий Pseudomonas stutzeri (131) ВКПМ В- 4727 ведут в сравнении со штаммом Proteus vulgaris ATCC 133115 ВКПМ В-1804. который синтезируют аналогично рестриктазу и

экспериментально проверен в лабораторных условиях на НПО Биолар.

Готовят среду для выращивания штамма следующего состава: 50 г/л рыбного гид- ролизата и 1,0 л воды.

Оживление штамма Rseudomonas stutzert 131 осуществляют на сухом питательном агаре (35 г/л сухого питательного агара и 1,0 л воды) в чашках Петри. Инкубируют в термокамере при 26°С в течение 18ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средой данного состава, рН 7,2.

Выращивают посевной материал при 26°С в течение 18 ч на качалке.

Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН 7,2, температуре 2б°С, перемешивании 200

об/мин, подаче воздуха - 2 объема воздуха на 1 объем питательной среды.

Выращивают до поздней логарифмической фазы роста. Выход биомассы 6,0-7,5 г/л культуралькой жидкости, выход ре- стриктазы Psu J 6000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культуральной жидкости.

Таким образом, при использовании штамма Pseudomonas stutzerl (131) ВКПМ В-4727 по сравнению с известным способом выход рестриктазы Psul возрастает с 1000 до 6000-9000 ед/г биомассы.

Формула изобретения Штамм бактерий Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 - продуцент рестриктазы Psul,

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной биологии. Цель изобретения - получение штамма Pseudomonas stutzerl В-4727 (t31), обладающего более высоким уровнем синтеза ре- стриктазы, узнающей палиндромную S CGAfCGS1 последовательность :1 и являю3 GCTAGCS щейся гомогенно чистой. Штамм культивируют на среде 3 с рыбным гидролизатом. В результате использования штамма Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 выход биомассы составляет 6,0-7,5 г/л культу- ральной жидкости, а выход рестриктазы Psu 16000-9000 ед/г биомассы или 36000-67500 ед/л культурэльной жидкости. 1 табл. ё