Штамм бактерий BacILLUS SтеаRотнеRморнILUS - продуцент рестриктазы BSS TI Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биот хноло- гии и генной инженерии, в частности к обна- ружению микроорганизма, способного синтезировать сайт-специфическую рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов СС (A/T)(A/T)GG и названную Bss Tl.

Целью изобретения является выявление штамма продуцента Bacillus stearothermophllus, обеспечивающего получение рестриктазы Bss Tl с более высоким выходом.

Штамм бактерий В. stearothermophllus получен в результате поиска и отбора при

экстремальных условиях культивирования (68-70°С) продуцентов рестриктаэ среди почвенных микроорганизмов.

Штамм депонирован в ВКПМ ВНИИ генетики под редакционным номером В-4893 (коллекционный номер депозитора 360), а продуцируемая им эндонуклеаза рестрикции названа Bss Tl.

Морфолого-культуральные признаки. Клетки, выращенные в жидкой питательной среде, представляют тонкие, с закругленными концами грамположительные подвижные палочки, одиночные или в коротких цепочках. Размер клеток 3-4-0,5-1,0 мкм.

О 00

о о о о

Через 18-24 ч на плотной крахмало-аммиач- ной среде клетки образуют терминально расположенные овальные споры, расширяющие ее тело. На рыбном питательном агаре - плоские округлые с неровным краем беспигментные колонии, 2,0-2,5 мм в диаметре, легко снимаются бактериологической петлей. Водорастворимый, пигмент в среде не обнаружен.

Строгий аэроб. Клетки в жидкой среде растут диффузно, без образования пленки и осадка. Температурные границы роста 40- 70°С. Растет в присутствии 5% хлористого натрия, при 10% - не растет. Рост отсутствует также в средах с 0,001% лизоцима и 0,02% азида натрия. Тесты на каталазу и оксидазу положительные, на индол, сероводород и ацетоин отрицательные. Восстанавливает нитраты, синтезирует щелочную фосфатазу. Усваивает глюкозу и галактозу с образованием кислоты. Не ферментирует арабинозу, лактозу, сахарозу, ксилозу, ман- нит и глицерин.

Штамм чувствителен к пенициллину, ампициллину, мономицину, тетрациклину, стрептомицину, левомицетину, оксацилли- ну, карбеницилину, гентамицину, устойчив к налидиксовой кислоте. Штамм не патогенен.

Культивирование проводят в питательной среде, содержащей 1 % бактотриптока, 0,5% дрожжевого экстракта, 1 % натрия хлористого, рН 7,0 в колбах на качалке со скоростью перемешивания 200-250 об/мин при 68-70°С. Выход биомассы 3,0-3,5 г влажных клеток на 1 л среды. Выход фермента Bss TI не менее 10000 ед. акт,/г влажной биомассы.

Полученная рестриктаза BssTI характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов CC(A/TXA/T)GG, оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8.0, оптимальная температура действия 50-55°С, оптимальная концентрация NaCI 50 мМ.

Определяющие отличия предлагаемого штамма В. stearothermophlliis (360) В-4893: высокое содержание рестриктазы Bss TI, составляющей 10000 ед.акт./г влажной биомассы (в 5 раз выше), отсутствие патоген- ности штамма, использование для культивирования микроорганизмов простой дешевой среды.

П р и м е р 1. Получение биомассы.

Клетки В. stearotnermophllus (360), хранящиеся подслоем вазелинового масла при 4°С, высевают на скошенный питательный агар и инкубируют при 68-70°С в течение 18ч. Затем клетки вносят в колбу с 50 мл

жидкой питательной среды и выращивают инокулят на качалке со скоростью вращения 200-250 об/мин при 68-70°С 18-20 ч. Полученную культуру из расчета 5-10% исполь.зуют для засева 250 мл среды, содержащей 1% бактотриптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% натрия хлористого. Дальнейшее культивирование проводят 16-18 ч на качалке в этих же условиях. Биомассу собирают

центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин на центрифуге Mistral.

Выход сырой биомассы 3,5 г/л культу- ральной жидкости.

П р и м е р 2. Выделение и очистка

рестриктазы Bss TI.

10 г клеток суспендируют в 30 мг 0,02 М трис-HCI буфера, рН 7,5, содержащего 1х10 3М/ -меркаптоэтанола и 0,1 % тритона Х-100, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием и надосадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А-0,5 М объемом 500 мл, уравновешенную 0,02 М калий- фосфатным буфером, содержащим 1x10 М

/ -меркаптоэтанола, 5x10 М ЭДТА, 0,8 М NaCI, 0,1% тритона Х-100 (буфер А). Фермент элюируют тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие

фермента. Фракции, содержащие ректрик- тазную активность, объединяют и диализу- ют против 2 л 0,02 М ка-лий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего М /3- меркаптоэтанолаибхЮ М ЭДТА (буфер В),

меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 50 мл с ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 500 мл градиента NaCI

(0,1-ОМ) в буфере В. Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 500 мл градиента NaCI (0,1-ОМ) в буфере В. Фракции, элюированные при 0,40-0,55 М NaCI, содержащие рестриктазу,

объединяют и диализуют против 2 л буфера В, меняя его дважды. Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 объемом 20 мл, уравновешенную буфером В. Элюацию фермента проводят 300 мл

градиента NaCI (0-1,ОМ) в буфере В. Фракции, содержащие максимальную активность рестриктазы, элюируемые при 0,66-0,7 М NaCI, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М NaCI и 50% глицерина,

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимого для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 50°С. Ферментный

препарат хранится при -20°С. Выход фермента 10000 ед./r биомассы, активность 10000 ед./мл.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Bss TI, проводят гидролиз ДНК фага ре- стриктазами Bss TI и Sty I по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестрик- тазами. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Bss TI и Sty I порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаэа Bss TI является изомером Sty I, узнает и расщепляет последовательность CC(A/TXA/T)GG,.

0

Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: растет на более доступной, дешевой среде без антибиотиков, обеспечивает повышенный выход рестриктазы BssTI.

Поскольку рестриктаза Bss TI имеет сайт узнавания CC(A/TXA/T)GG, идентичный сайту узнавания Sty I, она может заменить Sty I в экспериментах по фрагментации ДНК А по этим сайтам.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus stearo- 15 thermophllus ВКПМ В-4893 - продуцент рестриктазы BSSTI.